CAJ | 학술논문

背景:猪在遗传上与人类相似,因此猪是研究人类疾病最好的动物模型,而对于这方面的研究在国内外报道较少.目的:建立诱导性表达Cre重组酶的转基因载体.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-10/2008-05在吉林大学农学部畜牧兽医学院完成.材料:DH5a菌株E.coliDH5 α,质粒pcDNA3.1(+)、PET28a(+)、pCIneo.重组质粒PMD-Cre和猪成纤维细胞由北华大学医学部基础医学院细胞生物教研室保存;重组质粒pGC-FRT2NeoRRRR和Mx1克隆载体pGL3-Mx1由意大利Stefano教授馈赠.方法:构建的载体包括以下元件:Mx1启动子用来启动Cre的表达,Cre的作用是工具便于以后做基因敲除,BGHpolyA是一个终止信号,FRT2NeoR中的FRT是FLP酶的识别位点便于切除筛选标记,NeoR是筛选标记.通过聚合酶链反应方法分别从pGL3Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA.利用重叠聚合酶链反应方法获得猪源的Cre重组酶基冈.并从pGCFRT2NeoR上用Xhol I and Sal I酶切得到FRT2NeoR盒子.将上述4个片段利用SOE-PCR及酶连接的方法用T4 DNA连接酶连接,然后利用原核表达载体PET28a(+)构建出Cre表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR.主要观察指标:Cre重组酶表载体PET28a(+)-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR的鉴定.结果:PET28a(+)-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR重组质粒经Nhe I和Not I双酶切后完全符合理论上可切出的大小片段,载体构建成功.结论:成功的构建了诱导性表达Cre重组酶表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR.
배경:저재유전상여인류상사,인차저시연구인류질병최호적동물모형,이대우저방면적연구재국내외보도교소.목적:건립유도성표체Cre중조매적전기인재체.설계、시간급지점:단일양본관찰,우2007-10/2008-05재길림대학농학부축목수의학원완성.재료:DH5a균주E.coliDH5 α,질립pcDNA3.1(+)、PET28a(+)、pCIneo.중조질립PMD-Cre화저성섬유세포유북화대학의학부기출의학원세포생물교연실보존;중조질립pGC-FRT2NeoRRRR화Mx1극륭재체pGL3-Mx1유의대리Stefano교수궤증.방법:구건적재체포괄이하원건:Mx1계동자용래계동Cre적표체,Cre적작용시공구편우이후주기인고제,BGHpolyA시일개종지신호,FRT2NeoR중적FRT시FLP매적식별위점편우절제사선표기,NeoR시사선표기.통과취합매련반응방법분별종pGL3Mx1재체상화pcDNA3.1(+)재체상확증저Mx1계동자화BGHpolyA.이용중첩취합매련반응방법획득저원적Cre중조매기강.병종pGCFRT2NeoR상용Xhol I and Sal I매절득도FRT2NeoR합자.장상술4개편단이용SOE-PCR급매련접적방법용T4 DNA련접매련접,연후이용원핵표체재체PET28a(+)구건출Cre표체재체Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR.주요관찰지표:Cre중조매표재체PET28a(+)-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR적감정.결과:PET28a(+)-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR중조질립경Nhe I화Not I쌍매절후완전부합이론상가절출적대소편단,재체구건성공.결론:성공적구건료유도성표체Cre중조매표체재체Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR.