东北农业大学学报
東北農業大學學報
동북농업대학학보
JOURNAL OF NORTHEAST AGRICULTURAL UNIVERSITY
2010年
8期
48-53
,共6页
高明春%李雪萌%张润祥%王君伟
高明春%李雪萌%張潤祥%王君偉
고명춘%리설맹%장윤상%왕군위
大肠杆菌碱性磷酸酶%ATCC 25922%表达纯化%活性鉴定
大腸桿菌堿性燐痠酶%ATCC 25922%錶達純化%活性鑒定
대장간균감성린산매%ATCC 25922%표체순화%활성감정
使用常规PCR法以大肠杆菌菌株ATCC 25922基因组为模板,克隆到该菌株的碱性磷酸酶成熟肽基因,并将其构建到原核表达载体pET-30a(+)的Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ之间,获得重组表达载体pET-30a-EAP.并且我们将pET-30a-EAP转化到大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达后,获得大小为52 ku的目的蛋白EAP.经试验证明该蛋白以可溶形式为主.进而,高效表达的重组碱性磷酸酶经亲和层析法纯化后被用于活性鉴定.pNPP的显色反应与去磷酸化试验证实来自ATCC 25922的重组碱性磷酸酶具有催化磷酸单酯水解活性,而且酶热稳定性高、有效工作温度范围大,与其他蛋白融合表达时仍保持酶活性.以上研究结果为大肠杆菌菌株ATCC 25922碱性磷酸酶的规模化生产及在免疫酶技术领域中的应用提供了重要的参考依据.
使用常規PCR法以大腸桿菌菌株ATCC 25922基因組為模闆,剋隆到該菌株的堿性燐痠酶成熟肽基因,併將其構建到原覈錶達載體pET-30a(+)的Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ之間,穫得重組錶達載體pET-30a-EAP.併且我們將pET-30a-EAP轉化到大腸桿菌RosettaTM(DE3)pLysS中,經IPTG誘導錶達後,穫得大小為52 ku的目的蛋白EAP.經試驗證明該蛋白以可溶形式為主.進而,高效錶達的重組堿性燐痠酶經親和層析法純化後被用于活性鑒定.pNPP的顯色反應與去燐痠化試驗證實來自ATCC 25922的重組堿性燐痠酶具有催化燐痠單酯水解活性,而且酶熱穩定性高、有效工作溫度範圍大,與其他蛋白融閤錶達時仍保持酶活性.以上研究結果為大腸桿菌菌株ATCC 25922堿性燐痠酶的規模化生產及在免疫酶技術領域中的應用提供瞭重要的參攷依據.
사용상규PCR법이대장간균균주ATCC 25922기인조위모판,극륭도해균주적감성린산매성숙태기인,병장기구건도원핵표체재체pET-30a(+)적Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ지간,획득중조표체재체pET-30a-EAP.병차아문장pET-30a-EAP전화도대장간균RosettaTM(DE3)pLysS중,경IPTG유도표체후,획득대소위52 ku적목적단백EAP.경시험증명해단백이가용형식위주.진이,고효표체적중조감성린산매경친화층석법순화후피용우활성감정.pNPP적현색반응여거린산화시험증실래자ATCC 25922적중조감성린산매구유최화린산단지수해활성,이차매열은정성고、유효공작온도범위대,여기타단백융합표체시잉보지매활성.이상연구결과위대장간균균주ATCC 25922감성린산매적규모화생산급재면역매기술영역중적응용제공료중요적삼고의거.
