CAJ | 학술논문

人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题.通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法.采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SSA52.用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化予,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究.结果显示,RT-PCR产物约为1 400bp,与预期1 428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52 的相对分子质量约52 kD.Western blot法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带.DIGFA 与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2％( 120/126),阴性符合率为94.0％( 47/50),总符合率为94.9％( 167/176)；两种方法检测结果无统计学显著差异(P＞0.05).说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确.
인자신항원SSA52통상채용조직제취법혹원핵표체획득,존재제다문제.통과기인극륭기술,재필적효모중표체인자신항원SSA52,병건립반점면역금삼려법.채용RT-PCR확증SSA52기인,여효모표체재체pPIC9k중조,구건표체질립pPIC9k-SSA52.용전천공법전화효모균SMD1168,재MD평판상사선중조극륭,용G418쾌속사선고고패전화여,양성극륭경갑순유도표체후,배양상청액용십이완기류산납-취병희선알응효전영( SDS-PAGE)화단백질인적법(Western blot)감정,병건립반점면역금삼려법(dot immuogold filtration assay,DIGFA),진행초보림상응용대비연구.결과현시,RT-PCR산물약위1 400bp,여예기1 428 bp접근,pPIC9k-SSA52중조양성극륭측서결과여기인고핵산수거고보도완전일치,쌍매절감정정학,표체산물SSA52 적상대분자질량약52 kD.Western blot법증실표체산물구유천연SSA52분자적면역원성,음성대조균미견목적표체조대.DIGFA 여구몽매면역반점법적양성부합솔위95.2％( 120/126),음성부합솔위94.0％( 47/50),총부합솔위94.9％( 167/176)；량충방법검측결과무통계학현저차이(P＞0.05).설명SSA52재필적효모중분비표체성공,건립적DIGFA간편、쾌속、준학.