中国生物工程杂志
中國生物工程雜誌
중국생물공정잡지
JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY
2007年
5期
21-27
,共7页
窦佳%蔡河%姬芳玲%崔文举%王静云%包永明%安利佳
竇佳%蔡河%姬芳玲%崔文舉%王靜雲%包永明%安利佳
두가%채하%희방령%최문거%왕정운%포영명%안리가
磷脂酶A2%PCR 定点突变%固定化金属离子亲和层析%包涵体复性%蛋白表达
燐脂酶A2%PCR 定點突變%固定化金屬離子親和層析%包涵體複性%蛋白錶達
린지매A2%PCR 정점돌변%고정화금속리자친화층석%포함체복성%단백표체
为了确认49位谷氨酰胺磷脂酶A2(glutamine 49 phospholipase A2, Gln49-PLA2)酶活性缺失与氨基酸序列的相关性,对Gln49-PLA2编码基因第49位氨基酸进行PCR定点突变,利用pET32a+质粒载体在大肠杆菌中表达Gln49-磷脂酶A2的突变体--天冬氨酸磷脂酶A2(aspartic acid 49 phospholipase A2, Asp49-PLA2-Q49D-PLA2).将表达的包涵体蛋白变性,采用固定化金属离子亲和层析进行柱上复性、纯化获得突变体融合蛋白(fusion Q49D-PLA2-fQ49D-PLA2);突变体融合蛋白经蛋白水解酶Factor Xa酶切后,采用Hitrap SP阳离子交换层析和Superdex 75凝胶层析进一步纯化,得到突变体蛋白Q49D-PLA2,得率为1.3%,比酶活为72U/mg.从而证实Gln49-PLA2酶活性缺失的关键原因是49位氨基酸为谷氨酰胺.
為瞭確認49位穀氨酰胺燐脂酶A2(glutamine 49 phospholipase A2, Gln49-PLA2)酶活性缺失與氨基痠序列的相關性,對Gln49-PLA2編碼基因第49位氨基痠進行PCR定點突變,利用pET32a+質粒載體在大腸桿菌中錶達Gln49-燐脂酶A2的突變體--天鼕氨痠燐脂酶A2(aspartic acid 49 phospholipase A2, Asp49-PLA2-Q49D-PLA2).將錶達的包涵體蛋白變性,採用固定化金屬離子親和層析進行柱上複性、純化穫得突變體融閤蛋白(fusion Q49D-PLA2-fQ49D-PLA2);突變體融閤蛋白經蛋白水解酶Factor Xa酶切後,採用Hitrap SP暘離子交換層析和Superdex 75凝膠層析進一步純化,得到突變體蛋白Q49D-PLA2,得率為1.3%,比酶活為72U/mg.從而證實Gln49-PLA2酶活性缺失的關鍵原因是49位氨基痠為穀氨酰胺.
위료학인49위곡안선알린지매A2(glutamine 49 phospholipase A2, Gln49-PLA2)매활성결실여안기산서렬적상관성,대Gln49-PLA2편마기인제49위안기산진행PCR정점돌변,이용pET32a+질립재체재대장간균중표체Gln49-린지매A2적돌변체--천동안산린지매A2(aspartic acid 49 phospholipase A2, Asp49-PLA2-Q49D-PLA2).장표체적포함체단백변성,채용고정화금속리자친화층석진행주상복성、순화획득돌변체융합단백(fusion Q49D-PLA2-fQ49D-PLA2);돌변체융합단백경단백수해매Factor Xa매절후,채용Hitrap SP양리자교환층석화Superdex 75응효층석진일보순화,득도돌변체단백Q49D-PLA2,득솔위1.3%,비매활위72U/mg.종이증실Gln49-PLA2매활성결실적관건원인시49위안기산위곡안선알.
