CAJ | 학술논문

目的:构建CYP2E1基因shRNA慢病毒表达载体,为研究CYP2E1在药物代谢和环境污染物代谢中的作用提供技术支持.方法:通过NCBI检索CYP2E1序列,设计合成3对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体PLKO.1-puro,将重组质粒转化到感受态JM107中.挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒.将质粒和包膜蛋白质粒共转染到293FT细胞,收集病毒上清,转导肝细胞L02,利用嘌呤霉素筛选得到CYP2E1缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果.结果:PCR和测序结果证明双链shRNA已经正确插入慢病毒载体PLKO.1-puro,共转染293FT细胞得到高滴度病毒,转导L02细胞筛选出CYP2E1 基因沉默细胞,荧光定量PCR检测shRNA3的最高抑制效率为86.9％,Western blot鉴定shRNA3基本无CYP2E1表达.结论:利用慢病毒介导RNAi技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞.
목적:구건CYP2E1기인shRNA만병독표체재체,위연구CYP2E1재약물대사화배경오염물대사중적작용제공기술지지.방법:통과NCBI검색CYP2E1서렬,설계합성3대shRNA편단,퇴화후련접도만병독재체PLKO.1-puro,장중조질립전화도감수태JM107중.도취사선적단균락,경PCR화측서감정후제취질립.장질립화포막단백질립공전염도293FT세포,수집병독상청,전도간세포L02,이용표령매소사선득도CYP2E1결함형세포,최후이용형광정량PCR화Western blot감정간우효과.결과:PCR화측서결과증명쌍련shRNA이경정학삽입만병독재체PLKO.1-puro,공전염293FT세포득도고적도병독,전도L02세포사선출CYP2E1 기인침묵세포,형광정량PCR검측shRNA3적최고억제효솔위86.9％,Western blot감정shRNA3기본무CYP2E1표체.결론:이용만병독개도RNAi기술성공구건료CYP2E1기인침묵세포.