华中科技大学学报（医学版）
華中科技大學學報（醫學版）
화중과기대학학보（의학판）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINAE TONGJI
2008年
1期
97-100,108
,共5页
桂伶俐%刘志恒%张传汉%祝畅%高峰
桂伶俐%劉誌恆%張傳漢%祝暢%高峰
계령리%류지항%장전한%축창%고봉
干细胞移植%脑缺血%核因子闎%逆转录病毒科
榦細胞移植%腦缺血%覈因子闎%逆轉錄病毒科
간세포이식%뇌결혈%핵인자천%역전록병독과
目的 构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、pS0基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株.方法 以ReCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、测序鉴定.将重组载体及空载体分别转染包装细胞系PT67,以G418或潮霉素筛选产毒细胞株.收集病毒悬液,测定病毒滴度,并瞬时感染NIH3T3细胞及人神经干细胞,72 h后分别采用RT-PCR和免疫细胞化学观察p65、p50的表达.结果 重组逆转录病毒载体pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、测序鉴定正确.将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,测定病毒滴度分别为4×105、6 × 105、2×105及1 × 105efu/ml.pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒悬液瞬时感染NIH3T3细胞72 h后,细胞p65、p50亚基mRNA的表达明显升高;瞬时感染人神经干细胞(hNSC)72 h后,部分细胞胞核呈p65和p50阳性染色.结论 成功构建了分别携带人p65、p50基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株.为探讨转NF-κB基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础.
目的 構建分彆攜帶人覈因子-κB(NF-κB)亞基p65、pS0基因的逆轉錄病毒載體,併建立穩定產毒的包裝細胞株.方法 以ReCMV-p65、RcCMV-p50質粒為模闆,PCR擴增p65、p50基因編碼區全長序列,分彆剋隆至逆轉錄病毒空載體pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、測序鑒定.將重組載體及空載體分彆轉染包裝細胞繫PT67,以G418或潮黴素篩選產毒細胞株.收集病毒懸液,測定病毒滴度,併瞬時感染NIH3T3細胞及人神經榦細胞,72 h後分彆採用RT-PCR和免疫細胞化學觀察p65、p50的錶達.結果 重組逆轉錄病毒載體pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、測序鑒定正確.將篩選所得的高效產毒細胞株分彆命名為PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,測定病毒滴度分彆為4×105、6 × 105、2×105及1 × 105efu/ml.pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒懸液瞬時感染NIH3T3細胞72 h後,細胞p65、p50亞基mRNA的錶達明顯升高;瞬時感染人神經榦細胞(hNSC)72 h後,部分細胞胞覈呈p65和p50暘性染色.結論 成功構建瞭分彆攜帶人p65、p50基因的逆轉錄病毒載體,建立瞭穩定、高效、正確生產逆轉錄病毒的細胞株.為探討轉NF-κB基因神經榦細胞在缺血性卒中的運用前景奠定瞭實驗基礎.
목적 구건분별휴대인핵인자-κB(NF-κB)아기p65、pS0기인적역전록병독재체,병건립은정산독적포장세포주.방법 이ReCMV-p65、RcCMV-p50질립위모판,PCR확증p65、p50기인편마구전장서렬,분별극륭지역전록병독공재체pMSCVneo、pMSCVhyg,매절、측서감정.장중조재체급공재체분별전염포장세포계PT67,이G418혹조매소사선산독세포주.수집병독현액,측정병독적도,병순시감염NIH3T3세포급인신경간세포,72 h후분별채용RT-PCR화면역세포화학관찰p65、p50적표체.결과 중조역전록병독재체pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50적매절、측서감정정학.장사선소득적고효산독세포주분별명명위PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50급PT67/pMSCVhyg,측정병독적도분별위4×105、6 × 105、2×105급1 × 105efu/ml.pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50병독현액순시감염NIH3T3세포72 h후,세포p65、p50아기mRNA적표체명현승고;순시감염인신경간세포(hNSC)72 h후,부분세포포핵정p65화p50양성염색.결론 성공구건료분별휴대인p65、p50기인적역전록병독재체,건립료은정、고효、정학생산역전록병독적세포주.위탐토전NF-κB기인신경간세포재결혈성졸중적운용전경전정료실험기출.
