生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2008年
9期
1538-1544
,共7页
施庚寿%吴晓洁%熊福银%周艳荣%刘珠果%邓继先%陈红星
施庚壽%吳曉潔%熊福銀%週豔榮%劉珠果%鄧繼先%陳紅星
시경수%오효길%웅복은%주염영%류주과%산계선%진홍성
细菌人工染色体%Gap-repair%乳清酸蛋白%人乳铁蛋白
細菌人工染色體%Gap-repair%乳清痠蛋白%人乳鐵蛋白
세균인공염색체%Gap-repair%유청산단백%인유철단백
为了构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人乳铁蛋白(hLF)基因组序列在乳腺特异性高效表达的mWAP-hLF杂合基因座,我们采用了连续三步‘Gap-repair'的方法.首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体.然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的gap-repair技术,第一步从含mWAP基因座的细菌人工染色体(mWAP BAC)上亚克隆了8 kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从hLF BAC上亚克隆29 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLF基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆12 kb的mWAP基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个全长约49 kb的mWAP.hLF杂合基因座.经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,我们构建的这个杂合基因座,达到了原来mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hLF基因组序列精确置换的目的.这种连续三步gap-repair构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,将为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法.
為瞭構建一箇利用小鼠乳清痠蛋白(mWAP)基因座完整的上下遊調控序列指導人乳鐵蛋白(hLF)基因組序列在乳腺特異性高效錶達的mWAP-hLF雜閤基因座,我們採用瞭連續三步‘Gap-repair'的方法.首先,以pBR322載體作為骨架,插入預先無痕連接在一起的6箇同源臂,構成能連續進行三次gap-repair的基因抓捕載體.然後在大腸桿菌內利用Red同源重組繫統介導的gap-repair技術,第一步從含mWAP基因座的細菌人工染色體(mWAP BAC)上亞剋隆瞭8 kb的mWAP基因3'耑完整側翼序列到抓捕載體上;第二步,從hLF BAC上亞剋隆29 kb的從起始密碼子(ATG)到終止密碼子(TAA)的hLF基因組序列;第三步,從mWAP BAC上亞剋隆12 kb的mWAP基因5'耑完整側翼序列,併使這3箇基因片段在抓捕載體上自動無痕地連接在一起,形成一箇全長約49 kb的mWAP.hLF雜閤基因座.經過PCR擴增、限製性內切酶消化和序列測定驗證,我們構建的這箇雜閤基因座,達到瞭原來mWAP基因座中mWAP基因組編碼序列從起始密碼子到終止密碼子被hLF基因組序列精確置換的目的.這種連續三步gap-repair構建雜閤基因座乳腺錶達載體的技術,將為乳腺生物反應器高效錶達大載體的製備提供一種全新的思路和方法.
위료구건일개이용소서유청산단백(mWAP)기인좌완정적상하유조공서렬지도인유철단백(hLF)기인조서렬재유선특이성고효표체적mWAP-hLF잡합기인좌,아문채용료련속삼보‘Gap-repair'적방법.수선,이pBR322재체작위골가,삽입예선무흔련접재일기적6개동원비,구성능련속진행삼차gap-repair적기인조포재체.연후재대장간균내이용Red동원중조계통개도적gap-repair기술,제일보종함mWAP기인좌적세균인공염색체(mWAP BAC)상아극륭료8 kb적mWAP기인3'단완정측익서렬도조포재체상;제이보,종hLF BAC상아극륭29 kb적종기시밀마자(ATG)도종지밀마자(TAA)적hLF기인조서렬;제삼보,종mWAP BAC상아극륭12 kb적mWAP기인5'단완정측익서렬,병사저3개기인편단재조포재체상자동무흔지련접재일기,형성일개전장약49 kb적mWAP.hLF잡합기인좌.경과PCR확증、한제성내절매소화화서렬측정험증,아문구건적저개잡합기인좌,체도료원래mWAP기인좌중mWAP기인조편마서렬종기시밀마자도종지밀마자피hLF기인조서렬정학치환적목적.저충련속삼보gap-repair구건잡합기인좌유선표체재체적기술,장위유선생물반응기고효표체대재체적제비제공일충전신적사로화방법.
