中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2008年
41期
8103-8106
,共4页
刘铁连%谢宇锋%盛伟华%缪竞成%单云波%胡志清%井莹莹%杨吉成
劉鐵連%謝宇鋒%盛偉華%繆競成%單雲波%鬍誌清%井瑩瑩%楊吉成
류철련%사우봉%성위화%무경성%단운파%호지청%정형형%양길성
血管生成素1%血管内皮生长因子%腺病毒载体%构建
血管生成素1%血管內皮生長因子%腺病毒載體%構建
혈관생성소1%혈관내피생장인자%선병독재체%구건
目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平.方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGFl65,经Pad线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165.结果:PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,Pmel线性化后重组腺病毒载体获得成功包装.脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010 pfu/mL.转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P＜0.05).结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达.
目的:擬構建人血管生成素1和血管內皮生長因子165腺病毒載體,觀察靶細胞轉染後目的基因的錶達水平.方法:通過RT-PCR方法剋隆人Ang-1全長編碼基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165質粒為模闆擴增VEGF165基因,分彆將目的基因酶切連接到帶有GFP標記的pTrack-CMV質粒上,構建重組質粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,經PCR、酶切和測序鑒定後將其PmeI線性化與腺病毒質粒pAdeasy-1共轉化BJ5183細菌,穫得重組腺病毒載體pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGFl65,經Pad線性化後轉染QBI-293A包裝細胞,收穫重組腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165.結果:PCR、雙酶切和測序鑒定結果證實成功構建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重組轉移質粒,Pmel線性化後重組腺病毒載體穫得成功包裝.脂質體轉染QBI-293A細胞後光鏡下可見由腺病毒引起的細胞圓縮、聚集呈菌落狀的典型細胞病理性改變;熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的錶達,且熒光彊度隨培養時間延長而逐漸增彊;經多輪感染、擴增後,病毒效價可達(2.0～5.0)×1010 pfu/mL.轉染48h後,293A細胞中的血管生成素1與血管內皮生長因子含量均明顯提高(F=427.93,17.93,P＜0.05).結論:成功構建併穫得瞭Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重組腺病毒,血管生成素1與血管內皮生長因子165均能在靶細胞中有效錶達.
목적:의구건인혈관생성소1화혈관내피생장인자165선병독재체,관찰파세포전염후목적기인적표체수평.방법:통과RT-PCR방법극륭인Ang-1전장편마기인,PCR법이pcDNA3.0-VEGF165질립위모판확증VEGF165기인,분별장목적기인매절련접도대유GFP표기적pTrack-CMV질립상,구건중조질립pTrack-CMV-Ang-1화pTrack-CMV-VEGF165,경PCR、매절화측서감정후장기PmeI선성화여선병독질립pAdeasy-1공전화BJ5183세균,획득중조선병독재체pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGFl65,경Pad선성화후전염QBI-293A포장세포,수획중조선병독Ad-Ang-1급Ad-VEGF165.결과:PCR、쌍매절화측서감정결과증실성공구건pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165중조전이질립,Pmel선성화후중조선병독재체획득성공포장.지질체전염QBI-293A세포후광경하가견유선병독인기적세포원축、취집정균락상적전형세포병이성개변;형광현미경하가견록색형광단백적표체,차형광강도수배양시간연장이축점증강;경다륜감염、확증후,병독효개가체(2.0～5.0)×1010 pfu/mL.전염48h후,293A세포중적혈관생성소1여혈관내피생장인자함량균명현제고(F=427.93,17.93,P＜0.05).결론:성공구건병획득료Ad-Ang-1급Ad-VEGF165중조선병독,혈관생성소1여혈관내피생장인자165균능재파세포중유효표체.
