CAJ | 학술논문

背景:近年来许多研究发现血红素加氧酶1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,并且在心肌缺血-再灌注损伤等应激反应中有重要的保护作用,从而成为研究热点.目的:克隆大鼠血红素加氧酶1全长基因,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建血红素加氧酶1的真核表达载体.设计、时间及地点:实验于2008-03/06在苏州大学生物技术研究所完成.材料:成年雄件SD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供,用于脾脏细胞总RNA的提取;克隆载体PMDl8-T购自Takara公司;表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学生物技术研究所保存.方法:分离大鼠脾脏获取脾脏细胞,Trizol法提取脾脏细胞的总RNA,经反转录一聚合酶链反应扩增获得血红素加氧酶1基因,将扩增出来的产物与克隆载体PMDl8.T连接,转化TOP10感受态细菌,挑取阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序确证.测序正确后抽提质粒作为模板进行PCR,Sal-Ⅰ和BamH-Ⅰ同时双酶切PCR产物和载体PIRES2-EGFP,再在T4 DNA连接酶的作用下进行连接,构建其真核表达载体.主要观察指标:血红素加氧酶1基因的克隆和DNA测序结果证实序列是否正确;PIRES2.EGFP/血红素加氧酶1真核表达载体的构建以及测序证实目的基因成功插入载体.结果;①实验完成了大鼠血红素加氧酶1基因的克隆,所获得的序列与GeneBank中收录的大鼠血红素加氧酶1序列完全一致.②构建真核表达载体PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1,测序正确说明血红素加氧酶1基因成功插入表达载体PIRES2-EGFP中.结论:实验成功克隆了大鼠血红素加氧酶1基因全长,并构建了其真核表达载体.
배경:근년래허다연구발현혈홍소가양매1구유항염、항양화급항조망등작용,병차재심기결혈-재관주손상등응격반응중유중요적보호작용,종이성위연구열점.목적:극륭대서혈홍소가양매1전장기인,병장기우진핵표체재체PIRES2-EGFP상련접,구건혈홍소가양매1적진핵표체재체.설계、시간급지점:실험우2008-03/06재소주대학생물기술연구소완성.재료:성년웅건SD대서,유소주대학동물실험중심제공,용우비장세포총RNA적제취;극륭재체PMDl8-T구자Takara공사;표체재체PIRES2-EGFP유소주대학생물기술연구소보존.방법:분리대서비장획취비장세포,Trizol법제취비장세포적총RNA,경반전록일취합매련반응확증획득혈홍소가양매1기인,장확증출래적산물여극륭재체PMDl8.T련접,전화TOP10감수태세균,도취양성극륭경PCR급매절감정후측서학증.측서정학후추제질립작위모판진행PCR,Sal-Ⅰ화BamH-Ⅰ동시쌍매절PCR산물화재체PIRES2-EGFP,재재T4 DNA련접매적작용하진행련접,구건기진핵표체재체.주요관찰지표:혈홍소가양매1기인적극륭화DNA측서결과증실서렬시부정학;PIRES2.EGFP/혈홍소가양매1진핵표체재체적구건이급측서증실목적기인성공삽입재체.결과;①실험완성료대서혈홍소가양매1기인적극륭,소획득적서렬여GeneBank중수록적대서혈홍소가양매1서렬완전일치.②구건진핵표체재체PIRES2-EGFP/혈홍소가양매1,측서정학설명혈홍소가양매1기인성공삽입표체재체PIRES2-EGFP중.결론:실험성공극륭료대서혈홍소가양매1기인전장,병구건료기진핵표체재체.