南方医科大学学报
南方醫科大學學報
남방의과대학학보
JOURNAL OF SOUTHERN MEDICAL UNIVERSITY
2009年
3期
381-386
,共6页
刘芸%刘爱华%邓鹏%吴向玲%李涛%刘亚伟%徐佳%姜勇
劉蕓%劉愛華%鄧鵬%吳嚮玲%李濤%劉亞偉%徐佳%薑勇
류예%류애화%산붕%오향령%리도%류아위%서가%강용
SARS冠状病毒%S2蛋白%胞外段%蛋白表达%细胞膜融合
SARS冠狀病毒%S2蛋白%胞外段%蛋白錶達%細胞膜融閤
SARS관상병독%S2단백%포외단%단백표체%세포막융합
目的 构建SARS冠状病毒S2蛋白胞外段( S2ED)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达质粒,获得在原核细胞中表达的目的 蛋白.方法 在生物信息学预测基础上,利用PCR方法 扩增S2ED和EGFP的编码序列,插入到质粒pET-14b中构建融合表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白His-S2ED-EGFP.采用Ni-NTA亲和树脂纯化融合蛋白可溶部分,利用SDS-PAGE和免疫印迹的方法 鉴定纯化后的蛋白,通过荧光显微镜考察S2ED与Hela细胞胞膜能否发生融合效应.结果 重组质粒pET-14b-S2ED- EGFP的构建正确无误,并能够在BL21(DE3)中高效表达.纯化后的蛋白与Hela细胞孵育后,未观察到蛋白通过膜融合的过程内化进入细胞.结论 S2ED的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功,并在原核细胞中获得了部分可溶的表达和有效的纯化.虽然原核表达的重组蛋白未能在Hela细胞上发挥预期的生物学效应,但是该工作将为加深S2蛋白介导的胞膜融合过程的认识以及未来进行以特异性细胞结合肽为基础的定向靶细胞转运系统研究奠定重要的基础.
目的 構建SARS冠狀病毒S2蛋白胞外段( S2ED)和增彊型綠色熒光蛋白(EGFP)的融閤蛋白錶達質粒,穫得在原覈細胞中錶達的目的 蛋白.方法 在生物信息學預測基礎上,利用PCR方法 擴增S2ED和EGFP的編碼序列,插入到質粒pET-14b中構建融閤錶達載體,在大腸桿菌中誘導錶達融閤蛋白His-S2ED-EGFP.採用Ni-NTA親和樹脂純化融閤蛋白可溶部分,利用SDS-PAGE和免疫印跡的方法 鑒定純化後的蛋白,通過熒光顯微鏡攷察S2ED與Hela細胞胞膜能否髮生融閤效應.結果 重組質粒pET-14b-S2ED- EGFP的構建正確無誤,併能夠在BL21(DE3)中高效錶達.純化後的蛋白與Hela細胞孵育後,未觀察到蛋白通過膜融閤的過程內化進入細胞.結論 S2ED的綠色熒光蛋白融閤錶達載體構建成功,併在原覈細胞中穫得瞭部分可溶的錶達和有效的純化.雖然原覈錶達的重組蛋白未能在Hela細胞上髮揮預期的生物學效應,但是該工作將為加深S2蛋白介導的胞膜融閤過程的認識以及未來進行以特異性細胞結閤肽為基礎的定嚮靶細胞轉運繫統研究奠定重要的基礎.
목적 구건SARS관상병독S2단백포외단( S2ED)화증강형록색형광단백(EGFP)적융합단백표체질립,획득재원핵세포중표체적목적 단백.방법 재생물신식학예측기출상,이용PCR방법 확증S2ED화EGFP적편마서렬,삽입도질립pET-14b중구건융합표체재체,재대장간균중유도표체융합단백His-S2ED-EGFP.채용Ni-NTA친화수지순화융합단백가용부분,이용SDS-PAGE화면역인적적방법 감정순화후적단백,통과형광현미경고찰S2ED여Hela세포포막능부발생융합효응.결과 중조질립pET-14b-S2ED- EGFP적구건정학무오,병능구재BL21(DE3)중고효표체.순화후적단백여Hela세포부육후,미관찰도단백통과막융합적과정내화진입세포.결론 S2ED적록색형광단백융합표체재체구건성공,병재원핵세포중획득료부분가용적표체화유효적순화.수연원핵표체적중조단백미능재Hela세포상발휘예기적생물학효응,단시해공작장위가심S2단백개도적포막융합과정적인식이급미래진행이특이성세포결합태위기출적정향파세포전운계통연구전정중요적기출.
