中国药理学通报
中國藥理學通報
중국약이학통보
CHINESE PHARMACOLOGICAL BULLETIN
2007年
4期
451-458
,共8页
段红%李少林%唐树彬%尹晓玲%彭志平
段紅%李少林%唐樹彬%尹曉玲%彭誌平
단홍%리소림%당수빈%윤효령%팽지평
噬菌体抗体库%单链抗体%食管癌%基因工程抗体
噬菌體抗體庫%單鏈抗體%食管癌%基因工程抗體
서균체항체고%단련항체%식관암%기인공정항체
目的 构建全人源化食管癌噬菌体单链抗体库,从中筛选Eca-109细胞特异性单链抗体.方法 取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源,提取总RNA,用RT-PCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库.首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对,以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段,再以它们为模板分别扩增VH-linker与VL-linker,用SOE-PCR技术将后者组装成scFv,再引入酶切位点Sfi I和Not I.将scFv基因克隆入噬菌粒载体 pCANTAB-5E后电转入Ecoli TG1,经抗体表达的辅助噬菌体M13KO7超感染,构建单链抗体库.PCR鉴定阳性重组菌Ecoli TG1中scFv的插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和Not I双酶切质粒的结果.从该抗体库中筛选特异性识别Eca109细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化Ecoli HB2151进行可溶性表达.抗体亲和层析纯化后经SDS-PAGE、Western blot鉴定,通过ELISA法、免疫组化法、免疫细胞化学鉴定其与人食管癌细胞的结合的特异性.结果 食管癌周围淋巴结总RNA的提取琼脂糖电泳结果中可见清晰的28 S、18 S条带;VH基因的大小约为450 bp,VL基因为350 bp,组装后的scFv基因约为850 bp.用pUC18标准质粒测定转化效率达到108 cfu·μg-1.scFv的阳性插入率为91.7%(22/24).在筛选过程中,食管癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第4轮为第1轮的141倍;SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体分子量为30 ku左右,在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达.免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅食管癌组织着色,而肝癌、胃癌组织不染色.免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使食管癌细胞Eca109染色.细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与Eca109细胞结合,而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合.结论 从食管癌病人癌肿周围淋巴结成功地构建人源食管癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到食管癌特异性抗体.
目的 構建全人源化食管癌噬菌體單鏈抗體庫,從中篩選Eca-109細胞特異性單鏈抗體.方法 取食管癌病人癌腫週圍淋巴結作為B細胞的來源,提取總RNA,用RT-PCR的方法穫得抗體可變區基因cDNA文庫.首先分彆網格篩選確定擴增VH和VL基因片段的引物對,以cDNA為模闆擴增VH和VL基因片段,再以它們為模闆分彆擴增VH-linker與VL-linker,用SOE-PCR技術將後者組裝成scFv,再引入酶切位點Sfi I和Not I.將scFv基因剋隆入噬菌粒載體 pCANTAB-5E後電轉入Ecoli TG1,經抗體錶達的輔助噬菌體M13KO7超感染,構建單鏈抗體庫.PCR鑒定暘性重組菌Ecoli TG1中scFv的插入率,1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定Sfi I和Not I雙酶切質粒的結果.從該抗體庫中篩選特異性識彆Eca109細胞的單鏈抗體,將暘性剋隆菌轉化Ecoli HB2151進行可溶性錶達.抗體親和層析純化後經SDS-PAGE、Western blot鑒定,通過ELISA法、免疫組化法、免疫細胞化學鑒定其與人食管癌細胞的結閤的特異性.結果 食管癌週圍淋巴結總RNA的提取瓊脂糖電泳結果中可見清晰的28 S、18 S條帶;VH基因的大小約為450 bp,VL基因為350 bp,組裝後的scFv基因約為850 bp.用pUC18標準質粒測定轉化效率達到108 cfu·μg-1.scFv的暘性插入率為91.7%(22/24).在篩選過程中,食管癌噬菌體單鏈抗體得到富集,收穫率逐輪得到提高,第4輪為第1輪的141倍;SDS-PAGE與Western blot結果顯示抗體分子量為30 ku左右,在Ecoli HB2151中實現瞭單鏈抗體的可溶性錶達.免疫組織化學結果提示可溶性抗體僅食管癌組織著色,而肝癌、胃癌組織不染色.免疫細胞化學結果錶明此可溶性抗體可使食管癌細胞Eca109染色.細胞ELISA測定結果顯示可溶性抗體具有較高的特異性,能與Eca109細胞結閤,而不與胃癌BGC-823和NHEEC結閤.結論 從食管癌病人癌腫週圍淋巴結成功地構建人源食管癌噬菌體單鏈抗體庫,併從中篩選到食管癌特異性抗體.
목적 구건전인원화식관암서균체단련항체고,종중사선Eca-109세포특이성단련항체.방법 취식관암병인암종주위림파결작위B세포적래원,제취총RNA,용RT-PCR적방법획득항체가변구기인cDNA문고.수선분별망격사선학정확증VH화VL기인편단적인물대,이cDNA위모판확증VH화VL기인편단,재이타문위모판분별확증VH-linker여VL-linker,용SOE-PCR기술장후자조장성scFv,재인입매절위점Sfi I화Not I.장scFv기인극륭입서균립재체 pCANTAB-5E후전전입Ecoli TG1,경항체표체적보조서균체M13KO7초감염,구건단련항체고.PCR감정양성중조균Ecoli TG1중scFv적삽입솔,1.5%경지당응효전영감정Sfi I화Not I쌍매절질립적결과.종해항체고중사선특이성식별Eca109세포적단련항체,장양성극륭균전화Ecoli HB2151진행가용성표체.항체친화층석순화후경SDS-PAGE、Western blot감정,통과ELISA법、면역조화법、면역세포화학감정기여인식관암세포적결합적특이성.결과 식관암주위림파결총RNA적제취경지당전영결과중가견청석적28 S、18 S조대;VH기인적대소약위450 bp,VL기인위350 bp,조장후적scFv기인약위850 bp.용pUC18표준질립측정전화효솔체도108 cfu·μg-1.scFv적양성삽입솔위91.7%(22/24).재사선과정중,식관암서균체단련항체득도부집,수획솔축륜득도제고,제4륜위제1륜적141배;SDS-PAGE여Western blot결과현시항체분자량위30 ku좌우,재Ecoli HB2151중실현료단련항체적가용성표체.면역조직화학결과제시가용성항체부식관암조직착색,이간암、위암조직불염색.면역세포화학결과표명차가용성항체가사식관암세포Eca109염색.세포ELISA측정결과현시가용성항체구유교고적특이성,능여Eca109세포결합,이불여위암BGC-823화NHEEC결합.결론 종식관암병인암종주위림파결성공지구건인원식관암서균체단련항체고,병종중사선도식관암특이성항체.
