CAJ | 학술논문

为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTr法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性.结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀.在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白.但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过NiNTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物.根据这一特性,经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白.所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%.Western -blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTr生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用.结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞.
위료건립고효쾌첩능분리대량중조B7-2-PE40KDEL융합단백적하유순화로선,비교료불동조합적순화책략화조건,포괄반상층석、금속오합층석、음리자교환층석、람염료친화층석화응효과려층석등,병채용MTr법검측해융합단백적파향살상활성.결과표명,재반상층석분리중소수상분별채용료상규적갑순화을정,결과위소분리적해중조융합단백균발생료변성,종색보주중분리출래취생성료서상침정.재람염료친화층석일보분리중,유우전균체단백중여친화수지발생비특이결합적성분교다,겁난구분목적단백화잡단백.단시,PRSETA-B7-2-PE40KDEL표체재체상대유번역증강서렬T7-g10,가재표체목적단백N단융합6개조안산,저십분유리우통과NiNTA금속오화층석법쾌속고순도지순화표체산물.근거저일특성,경반복사선실험설계최종학정료금속오합층석、음리자교환층석화응효과려층석삼보법적순화로선,용우순화분리B7-2-PE40KDEL융합단백.소득적목적단백적순도가체95%이상,총회수솔위8%.Western -blot실험현시,소득단백가여B7-2급PEA항체특이성결합;MTr생물활성측정표명,해융합단백대표체CD28수체적인T세포계Jurkat산생특이성살상작용,이대불표체CD28적림파세포계Raji무임하살상작용.결론:건립료고효쾌속순화대량중조B7-2-PE40KDEL융합단백적기술로선,소순화적중조B7-2-PE40KDEL융합단백능특이성파향살상표체CD28수체적인T세포.