CAJ | 학술논문

探讨新型纳米微囊载体应用于基因治疗的可行性,安全性、转染效率、转移方法并与阳离子脂质体、质粒DNA进行比较.方法:以血管内皮细胞生长因子(VEGF165)为目的基因,构建真核表达载体pcDM3.1/myc-hi sA-VEGF165,分别利用纳米微囊、阳离子脂质体介导VEGF165转染鼠成纤维细胞(3Y1),转染4h后镜下观察细胞转染后表型变化,24、48h后通过绿色荧光蛋白的表达观察瞬时转染效率,通过免疫组织化学、Western Blot检测基因表达水平及定位.MTT法检测对转基因细胞的毒性.ELISA检测经G418筛选后上清培养液VEGF蛋白持续表达情况.结果:经G418筛选后的阳性细胞克隆,为高表达VEGF的鼠成纤维细胞模型.免疫组织化学证实pcDNA3.1/myc-hisA-VEGF165在转基因的细胞中呈高表达,定位于胞浆.Western Blot结果显示纳米微囊转染3Y1细胞48h后细胞胞浆及培养上清中均有VEGF蛋白表达.免疫荧光显示纳米微囊转染效率明显高于相应浓度的阳离子脂质体,转染4h后镜下观察细胞表型显示1 0mM浓度纳米微囊有较高的毒性.MTT测定示纳米微囊对3Y1细胞有显著的抑制增殖作用并随浓度梯度变化,ELISA检测发现纳米微囊、脂质体组培养上清中VEGF蛋白表达水平可维持4周,但纳米微囊组随时间变化而下降,瞬时表达水平高于脂质体组.结论:纳米微囊转基因载体作为一种新型非病毒载体,具备基因治疗应用潜能,可能为血管重建基因治疗提供了一种新的模式.
탐토신형납미미낭재체응용우기인치료적가행성,안전성、전염효솔、전이방법병여양리자지질체、질립DNA진행비교.방법:이혈관내피세포생장인자(VEGF165)위목적기인,구건진핵표체재체pcDM3.1/myc-hi sA-VEGF165,분별이용납미미낭、양리자지질체개도VEGF165전염서성섬유세포(3Y1),전염4h후경하관찰세포전염후표형변화,24、48h후통과록색형광단백적표체관찰순시전염효솔,통과면역조직화학、Western Blot검측기인표체수평급정위.MTT법검측대전기인세포적독성.ELISA검측경G418사선후상청배양액VEGF단백지속표체정황.결과:경G418사선후적양성세포극륭,위고표체VEGF적서성섬유세포모형.면역조직화학증실pcDNA3.1/myc-hisA-VEGF165재전기인적세포중정고표체,정위우포장.Western Blot결과현시납미미낭전염3Y1세포48h후세포포장급배양상청중균유VEGF단백표체.면역형광현시납미미낭전염효솔명현고우상응농도적양리자지질체,전염4h후경하관찰세포표형현시1 0mM농도납미미낭유교고적독성.MTT측정시납미미낭대3Y1세포유현저적억제증식작용병수농도제도변화,ELISA검측발현납미미낭、지질체조배양상청중VEGF단백표체수평가유지4주,단납미미낭조수시간변화이하강,순시표체수평고우지질체조.결론:납미미낭전기인재체작위일충신형비병독재체,구비기인치료응용잠능,가능위혈관중건기인치료제공료일충신적모식.