畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2012年
8期
1192-1199
,共8页
张存芳%王令%任刚%张婷婷%王瑞%严国勇%张智英
張存芳%王令%任剛%張婷婷%王瑞%嚴國勇%張智英
장존방%왕령%임강%장정정%왕서%엄국용%장지영
锌指核酸酶%MSTN基因%腺病毒%基因敲除
鋅指覈痠酶%MSTN基因%腺病毒%基因敲除
자지핵산매%MSTN기인%선병독%기인고제
旨在构建并包装打靶绵羊MSTN基因的位点特异性锌指核酸酶腺病毒表达载体,以借助腺病毒的高转染效率和非整合性以及锌指核酸酶的高效性和特异性实现对绵羊MSTN基因的敲除.本研究利用PCR扩增T2A序列和锌指核酸酶异源二聚体序列,测序鉴定后依次克隆至pAdTrack -CMV,得到pAdTrack-ZFNL-T2A-ZFNR穿梭载体,将之与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共转染至BJ5183菌株进行同源重组,以构建pAdEasy-ZFNL -T2A-ZFNR表达载体.然后用上述表达载体转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装,将PCR鉴定阳性的病毒进行扩增并测定病毒滴度.侵染绵羊胎儿成纤维细胞检测重组腺病毒对靶细胞的侵染能力,并用Western blot方法检测绵羊胎儿成纤维细胞中ZFN的表达,进而在细胞水平验证ZFN的活性.结果,包装得到的锌指核酸酶重组腺病毒能够高效侵染绵羊胎儿成纤维细胞并表达ZFN,腺病毒介导的ZFN可识别并切割绵羊MSTN基因.本研究成功获得靶向识别并切割绵羊MSTN基因的锌指核酸酶重组腺病毒.
旨在構建併包裝打靶綿羊MSTN基因的位點特異性鋅指覈痠酶腺病毒錶達載體,以藉助腺病毒的高轉染效率和非整閤性以及鋅指覈痠酶的高效性和特異性實現對綿羊MSTN基因的敲除.本研究利用PCR擴增T2A序列和鋅指覈痠酶異源二聚體序列,測序鑒定後依次剋隆至pAdTrack -CMV,得到pAdTrack-ZFNL-T2A-ZFNR穿梭載體,將之與腺病毒骨架載體pAdEasy -1共轉染至BJ5183菌株進行同源重組,以構建pAdEasy-ZFNL -T2A-ZFNR錶達載體.然後用上述錶達載體轉染HEK293細胞進行重組腺病毒的包裝,將PCR鑒定暘性的病毒進行擴增併測定病毒滴度.侵染綿羊胎兒成纖維細胞檢測重組腺病毒對靶細胞的侵染能力,併用Western blot方法檢測綿羊胎兒成纖維細胞中ZFN的錶達,進而在細胞水平驗證ZFN的活性.結果,包裝得到的鋅指覈痠酶重組腺病毒能夠高效侵染綿羊胎兒成纖維細胞併錶達ZFN,腺病毒介導的ZFN可識彆併切割綿羊MSTN基因.本研究成功穫得靶嚮識彆併切割綿羊MSTN基因的鋅指覈痠酶重組腺病毒.
지재구건병포장타파면양MSTN기인적위점특이성자지핵산매선병독표체재체,이차조선병독적고전염효솔화비정합성이급자지핵산매적고효성화특이성실현대면양MSTN기인적고제.본연구이용PCR확증T2A서렬화자지핵산매이원이취체서렬,측서감정후의차극륭지pAdTrack -CMV,득도pAdTrack-ZFNL-T2A-ZFNR천사재체,장지여선병독골가재체pAdEasy -1공전염지BJ5183균주진행동원중조,이구건pAdEasy-ZFNL -T2A-ZFNR표체재체.연후용상술표체재체전염HEK293세포진행중조선병독적포장,장PCR감정양성적병독진행확증병측정병독적도.침염면양태인성섬유세포검측중조선병독대파세포적침염능력,병용Western blot방법검측면양태인성섬유세포중ZFN적표체,진이재세포수평험증ZFN적활성.결과,포장득도적자지핵산매중조선병독능구고효침염면양태인성섬유세포병표체ZFN,선병독개도적ZFN가식별병절할면양MSTN기인.본연구성공획득파향식별병절할면양MSTN기인적자지핵산매중조선병독.
