CAJ | 학술논문

目的构建pcDNA3.1 SHP-2野生型(WT)及SHP-2D61G突变型(MT)真核表达载体,为研究SHP-2激活突变对肿瘤恶性生物学行为的影响提供基础.方法用RT-PCR 及定点突变法从小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中扩增出目的片段,双酶切后定向连入 pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1 SHP-2野生型及SHP-2D61G/+真核表达质粒,经酶切、测序检测其构建的准确性;Western blot法检测转染 NIH3T3细胞中SHP-2蛋白的表达水平;免疫共沉淀法获得表达在NIH3T3细胞中的SHP-2蛋白,用 pNPP法检测其磷酸酶活性.结果构建的pcDNA3.1 SHP-2野生型及SHP-2D61G突变质粒经酶切初步检测后,测序检测发现MT SHP-2在181位核苷酸由WT的G突变为T,转染NIH3T3细胞株能够表达SHP-2蛋白;且转染MT的NIH3T3细胞株内SHP-2磷酸酶活性较WT组升高2倍(P<0.01).结论成功构建了pcDNA3.1 SHP-2野生型及SHP-2D61G突变型真核表达载体,SHP-2D61G突变的蛋白磷酸酶活性升高.
목적 구건pcDNA3.1 SHP-2야생형(WT)급SHP-2D61G돌변형(MT)진핵표체재체,위연구SHP-2격활돌변대종류악성생물학행위적영향제공기출.방법 용RT-PCR 급정점돌변법종소서배태성섬유세포(MEF)중확증출목적편단,쌍매절후정향련입 pcDNA3.1재체,구건pcDNA3.1 SHP-2야생형급SHP-2D61G/+진핵표체질립,경매절、측서검측기구건적준학성;Western blot법검측전염 NIH3T3세포중SHP-2단백적표체수평;면역공침정법획득표체재NIH3T3세포중적SHP-2단백,용 pNPP법검측기린산매활성.결과 구건적pcDNA3.1 SHP-2야생형급SHP-2D61G돌변질립경매절초보검측후,측서검측발현MT SHP-2재181위핵감산유WT적G돌변위T,전염NIH3T3세포주능구표체SHP-2단백;차전염MT적NIH3T3세포주내SHP-2린산매활성교WT조승고2배(P<0.01).결론 성공구건료pcDNA3.1 SHP-2야생형급SHP-2D61G돌변형진핵표체재체,SHP-2D61G돌변적단백린산매활성승고.