目的:局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)患者蛋白尿的发生与循环中存在某类物质相关.但循环因子的本质,其作用的靶细胞等问题都没有研究清楚.足细胞病变在大量蛋白尿发生中的重要性得到了充分的认识.本研究利用体外培养的分化足细胞作为检测循环因子的靶细胞,探讨了该方法的临床应用,并对循环因子的理化性质及其损伤足细胞的作用机制进行了研究. 方法:经肾活检明确诊断的FSGS患者80例和足细胞病(podocytopathy)患者74例作为研究对象,同时选取临床表现为肾病综合征,组织形态学改变为膜性肾病(MN)65例、IgM肾病(IgMN)14例,IgA肾病(IgAN)41例,糖尿病肾病(DN)13例,狼疮性肾炎(LN)23例,系膜增殖性肾炎(MPGN)15例作为疾病对照,患者血清以10%浓度作用足细胞24h,免疫荧光法观察足细胞骨架蛋白F-actin和足细胞膜连接分子(ZO-1)分布变化.同时,取上述患者0.1 ml血清注射大鼠,0h、4h、8h、12h和24h分别观察大鼠蛋白尿的产生,验证体外实验结果.阳性血清经灭活去补体,硫酸葡聚糖镁去脂,盐析法去IgG,阳性血清与患者或正常人尿液共孵育,及阳性血清与细胞因子IL-13中和抗体共孵育等不同处理后再作用足细胞,观察F-actin和ZO-1的变化,鉴定循环因子性质;Western blot检测患者血清对足细胞内细胞因子相关信号通路JAK-STAT 6,应激和细胞生存相关信号通路MAPK(p38, ERK,JNK)及骨架蛋白调节信号通路Rho-ROCK的影响,进一步深入研究循环因子对足细胞功能影响的分子机制. 结果:13例FSGS患者(16.3%)和9例足细胞病患者(12.2%)的血清可明显破坏足细胞的骨架结构和ZO-1的分布,胞质内F-actin表达减弱,细胞骨架断裂,排列紊乱,部分开始向细胞边缘聚集,形成毛刺样结构,足细胞失去原有的细胞张力,胞体回缩;相邻足细胞的紧密连接消失,ZO-1的连续性破坏,出现断裂,皱褶,分层.其它肾病患者(MN,IgMN,IgAN,DN,LN,MPGN)的血清未能引起足细胞上述病变.阳性血清注射大鼠8h即可诱导大鼠产生明显的蛋白尿[(0.5±0.03) mg/ml vs (0.2±0.01) mg/ml阴性对照血清,P<0.01],12h大鼠蛋白尿的产生达到高峰,并持续到16h.阳性血清经去补体、去IgG、去除脂蛋白等处理后,血清对足细胞骨架蛋白损伤作用未受影响.循环因子阳性血清与尿液或正常人血清共孵育足细胞不能中和循环因子的损伤作用.细胞因子IL-13中和抗体未能阻断阳性血清诱导的足细胞损伤.进一步的信号分子研究显示,阳性血清作用30 min即可激活足细胞内多条信号通路,STAT 6,p-38 MAPK和Rho-ROCK底物MYPT1磷酸化水平显著升高,而阴性血清未能激活上述信号通路. 结论:循环因子特异性存在于部分FSGS和足细胞病变患者中,这类因子可以直接诱导足细胞损伤和蛋白尿的发生.进一步在临床上观察相应的治疗干预对FSGS患者这类循环因子的影响以及其消长与蛋白尿和预后的关系,有助于正确认识这类循环因子与疾病的关联,从而为最终明确这类循环因子的本质奠定基础.
目的:跼竈節段性腎小毬硬化癥(FSGS)患者蛋白尿的髮生與循環中存在某類物質相關.但循環因子的本質,其作用的靶細胞等問題都沒有研究清楚.足細胞病變在大量蛋白尿髮生中的重要性得到瞭充分的認識.本研究利用體外培養的分化足細胞作為檢測循環因子的靶細胞,探討瞭該方法的臨床應用,併對循環因子的理化性質及其損傷足細胞的作用機製進行瞭研究. 方法:經腎活檢明確診斷的FSGS患者80例和足細胞病(podocytopathy)患者74例作為研究對象,同時選取臨床錶現為腎病綜閤徵,組織形態學改變為膜性腎病(MN)65例、IgM腎病(IgMN)14例,IgA腎病(IgAN)41例,糖尿病腎病(DN)13例,狼瘡性腎炎(LN)23例,繫膜增殖性腎炎(MPGN)15例作為疾病對照,患者血清以10%濃度作用足細胞24h,免疫熒光法觀察足細胞骨架蛋白F-actin和足細胞膜連接分子(ZO-1)分佈變化.同時,取上述患者0.1 ml血清註射大鼠,0h、4h、8h、12h和24h分彆觀察大鼠蛋白尿的產生,驗證體外實驗結果.暘性血清經滅活去補體,硫痠葡聚糖鎂去脂,鹽析法去IgG,暘性血清與患者或正常人尿液共孵育,及暘性血清與細胞因子IL-13中和抗體共孵育等不同處理後再作用足細胞,觀察F-actin和ZO-1的變化,鑒定循環因子性質;Western blot檢測患者血清對足細胞內細胞因子相關信號通路JAK-STAT 6,應激和細胞生存相關信號通路MAPK(p38, ERK,JNK)及骨架蛋白調節信號通路Rho-ROCK的影響,進一步深入研究循環因子對足細胞功能影響的分子機製. 結果:13例FSGS患者(16.3%)和9例足細胞病患者(12.2%)的血清可明顯破壞足細胞的骨架結構和ZO-1的分佈,胞質內F-actin錶達減弱,細胞骨架斷裂,排列紊亂,部分開始嚮細胞邊緣聚集,形成毛刺樣結構,足細胞失去原有的細胞張力,胞體迴縮;相鄰足細胞的緊密連接消失,ZO-1的連續性破壞,齣現斷裂,皺褶,分層.其它腎病患者(MN,IgMN,IgAN,DN,LN,MPGN)的血清未能引起足細胞上述病變.暘性血清註射大鼠8h即可誘導大鼠產生明顯的蛋白尿[(0.5±0.03) mg/ml vs (0.2±0.01) mg/ml陰性對照血清,P<0.01],12h大鼠蛋白尿的產生達到高峰,併持續到16h.暘性血清經去補體、去IgG、去除脂蛋白等處理後,血清對足細胞骨架蛋白損傷作用未受影響.循環因子暘性血清與尿液或正常人血清共孵育足細胞不能中和循環因子的損傷作用.細胞因子IL-13中和抗體未能阻斷暘性血清誘導的足細胞損傷.進一步的信號分子研究顯示,暘性血清作用30 min即可激活足細胞內多條信號通路,STAT 6,p-38 MAPK和Rho-ROCK底物MYPT1燐痠化水平顯著升高,而陰性血清未能激活上述信號通路. 結論:循環因子特異性存在于部分FSGS和足細胞病變患者中,這類因子可以直接誘導足細胞損傷和蛋白尿的髮生.進一步在臨床上觀察相應的治療榦預對FSGS患者這類循環因子的影響以及其消長與蛋白尿和預後的關繫,有助于正確認識這類循環因子與疾病的關聯,從而為最終明確這類循環因子的本質奠定基礎.
목적:국조절단성신소구경화증(FSGS)환자단백뇨적발생여순배중존재모류물질상관.단순배인자적본질,기작용적파세포등문제도몰유연구청초.족세포병변재대량단백뇨발생중적중요성득도료충분적인식.본연구이용체외배양적분화족세포작위검측순배인자적파세포,탐토료해방법적림상응용,병대순배인자적이화성질급기손상족세포적작용궤제진행료연구. 방법:경신활검명학진단적FSGS환자80례화족세포병(podocytopathy)환자74례작위연구대상,동시선취림상표현위신병종합정,조직형태학개변위막성신병(MN)65례、IgM신병(IgMN)14례,IgA신병(IgAN)41례,당뇨병신병(DN)13례,랑창성신염(LN)23례,계막증식성신염(MPGN)15례작위질병대조,환자혈청이10%농도작용족세포24h,면역형광법관찰족세포골가단백F-actin화족세포막련접분자(ZO-1)분포변화.동시,취상술환자0.1 ml혈청주사대서,0h、4h、8h、12h화24h분별관찰대서단백뇨적산생,험증체외실험결과.양성혈청경멸활거보체,류산포취당미거지,염석법거IgG,양성혈청여환자혹정상인뇨액공부육,급양성혈청여세포인자IL-13중화항체공부육등불동처리후재작용족세포,관찰F-actin화ZO-1적변화,감정순배인자성질;Western blot검측환자혈청대족세포내세포인자상관신호통로JAK-STAT 6,응격화세포생존상관신호통로MAPK(p38, ERK,JNK)급골가단백조절신호통로Rho-ROCK적영향,진일보심입연구순배인자대족세포공능영향적분자궤제. 결과:13례FSGS환자(16.3%)화9례족세포병환자(12.2%)적혈청가명현파배족세포적골가결구화ZO-1적분포,포질내F-actin표체감약,세포골가단렬,배렬문란,부분개시향세포변연취집,형성모자양결구,족세포실거원유적세포장력,포체회축;상린족세포적긴밀련접소실,ZO-1적련속성파배,출현단렬,추습,분층.기타신병환자(MN,IgMN,IgAN,DN,LN,MPGN)적혈청미능인기족세포상술병변.양성혈청주사대서8h즉가유도대서산생명현적단백뇨[(0.5±0.03) mg/ml vs (0.2±0.01) mg/ml음성대조혈청,P<0.01],12h대서단백뇨적산생체도고봉,병지속도16h.양성혈청경거보체、거IgG、거제지단백등처리후,혈청대족세포골가단백손상작용미수영향.순배인자양성혈청여뇨액혹정상인혈청공부육족세포불능중화순배인자적손상작용.세포인자IL-13중화항체미능조단양성혈청유도적족세포손상.진일보적신호분자연구현시,양성혈청작용30 min즉가격활족세포내다조신호통로,STAT 6,p-38 MAPK화Rho-ROCK저물MYPT1린산화수평현저승고,이음성혈청미능격활상술신호통로. 결론:순배인자특이성존재우부분FSGS화족세포병변환자중,저류인자가이직접유도족세포손상화단백뇨적발생.진일보재림상상관찰상응적치료간예대FSGS환자저류순배인자적영향이급기소장여단백뇨화예후적관계,유조우정학인식저류순배인자여질병적관련,종이위최종명학저류순배인자적본질전정기출.
