CAJ | 학술논문

目的:建立一种根据基因芯片原理,对国内真菌性角膜病常见致病菌种进行快速检测和准确检测的实验方法.方法:实验于2004-11/2006-04在河南省生物工程中心分子生物学实验室和河南省角膜病重点实验室完成.将针对国内临床上常见的角膜致病真菌6属12种,包括腐皮镰孢菌、串珠镰孢菌、梨状镰孢菌、尖孢镰孢菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌、新月弯孢菌、牵连青霉菌、链格孢霉菌、白色念珠菌,并经修饰的特异性寡核苷酸探针固定在两种材料的片基上.用一对通用引物,对上述真菌的DNA基因片断进行扩增,将带有特殊标记的扩增产物与片基上排列的探针进行杂交,对12株标准菌株和82株临床分离株样本采用双盲法原则进行检测,从而对两种不同片基芯片的特异性和灵敏度进行判断和评估.结果:①在两种不同材料的片基上,均可以高效率结合经过修饰和加尾的寡核苷酸探针,玻片约为35 mer,尼龙膜约为400 mer,可靠性较好.②通过琼脂糖凝胶电泳观察,12种真菌均产生了530～630 bp的聚合酶链反应扩增产物,在相同的条件下对其进行杂交检测,得到了具有各自特征的杂交后显色图谱,玻片为荧光显色,尼龙膜为生物素-亲和素显色,可直接从杂交显色图谱上对不同菌种区分判断.③两种芯片均可与低于琼脂糖凝胶电泳显色浓度一个数量级的聚合酶链反应扩增产物反应,敏感性高于聚合酶链反应检测;在对82株临床分离株样本检测中,79株经聚合酶链反应扩增琼脂糖凝胶电泳均显示扩增产物条带,无非特异性杂交反应发生;玻片灵敏度为92.4%,尼龙膜灵敏度87.3%,χ2检验差异无显着性(P＞0.05).结论:实验建立了以ITS区基因为靶标的寡核苷酸探针芯片检测系统,具有较好的特异性和灵敏度,能够在三四个小时内完成对临床上常见的12种角膜致病真菌的菌种检测. 目的:建立一種根據基因芯片原理,對國內真菌性角膜病常見緻病菌種進行快速檢測和準確檢測的實驗方法.方法:實驗于2004-11/2006-04在河南省生物工程中心分子生物學實驗室和河南省角膜病重點實驗室完成.將針對國內臨床上常見的角膜緻病真菌6屬12種,包括腐皮鐮孢菌、串珠鐮孢菌、梨狀鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、煙麯黴菌、黃麯黴菌、土麯黴菌、黑麯黴菌、新月彎孢菌、牽連青黴菌、鏈格孢黴菌、白色唸珠菌,併經脩飾的特異性寡覈苷痠探針固定在兩種材料的片基上.用一對通用引物,對上述真菌的DNA基因片斷進行擴增,將帶有特殊標記的擴增產物與片基上排列的探針進行雜交,對12株標準菌株和82株臨床分離株樣本採用雙盲法原則進行檢測,從而對兩種不同片基芯片的特異性和靈敏度進行判斷和評估.結果:①在兩種不同材料的片基上,均可以高效率結閤經過脩飾和加尾的寡覈苷痠探針,玻片約為35 mer,尼龍膜約為400 mer,可靠性較好.②通過瓊脂糖凝膠電泳觀察,12種真菌均產生瞭530～630 bp的聚閤酶鏈反應擴增產物,在相同的條件下對其進行雜交檢測,得到瞭具有各自特徵的雜交後顯色圖譜,玻片為熒光顯色,尼龍膜為生物素-親和素顯色,可直接從雜交顯色圖譜上對不同菌種區分判斷.③兩種芯片均可與低于瓊脂糖凝膠電泳顯色濃度一箇數量級的聚閤酶鏈反應擴增產物反應,敏感性高于聚閤酶鏈反應檢測;在對82株臨床分離株樣本檢測中,79株經聚閤酶鏈反應擴增瓊脂糖凝膠電泳均顯示擴增產物條帶,無非特異性雜交反應髮生;玻片靈敏度為92.4%,尼龍膜靈敏度87.3%,χ2檢驗差異無顯著性(P＞0.05).結論:實驗建立瞭以ITS區基因為靶標的寡覈苷痠探針芯片檢測繫統,具有較好的特異性和靈敏度,能夠在三四箇小時內完成對臨床上常見的12種角膜緻病真菌的菌種檢測.
목적:건립일충근거기인심편원리,대국내진균성각막병상견치병균충진행쾌속검측화준학검측적실험방법.방법:실험우2004-11/2006-04재하남성생물공정중심분자생물학실험실화하남성각막병중점실험실완성.장침대국내림상상상견적각막치병진균6속12충,포괄부피렴포균、천주렴포균、리상렴포균、첨포렴포균、연곡매균、황곡매균、토곡매균、흑곡매균、신월만포균、견련청매균、련격포매균、백색념주균,병경수식적특이성과핵감산탐침고정재량충재료적편기상.용일대통용인물,대상술진균적DNA기인편단진행확증,장대유특수표기적확증산물여편기상배렬적탐침진행잡교,대12주표준균주화82주림상분리주양본채용쌍맹법원칙진행검측,종이대량충불동편기심편적특이성화령민도진행판단화평고.결과:①재량충불동재료적편기상,균가이고효솔결합경과수식화가미적과핵감산탐침,파편약위35 mer,니룡막약위400 mer,가고성교호.②통과경지당응효전영관찰,12충진균균산생료530～630 bp적취합매련반응확증산물,재상동적조건하대기진행잡교검측,득도료구유각자특정적잡교후현색도보,파편위형광현색,니룡막위생물소-친화소현색,가직접종잡교현색도보상대불동균충구분판단.③량충심편균가여저우경지당응효전영현색농도일개수량급적취합매련반응확증산물반응,민감성고우취합매련반응검측;재대82주림상분리주양본검측중,79주경취합매련반응확증경지당응효전영균현시확증산물조대,무비특이성잡교반응발생;파편령민도위92.4%,니룡막령민도87.3%,χ2검험차이무현착성(P＞0.05).결론:실험건립료이ITS구기인위파표적과핵감산탐침심편검측계통,구유교호적특이성화령민도,능구재삼사개소시내완성대림상상상견적12충각막치병진균적균충검측.