国际呼吸杂志
國際呼吸雜誌
국제호흡잡지
INTERNATIONAL JOURNAL OF RESPIRATION
2007年
23期
1761-1764
,共4页
李红鹏%邱海波%许德义%刘玲%王连%丁惠民%杨毅%周韶霞
李紅鵬%邱海波%許德義%劉玲%王連%丁惠民%楊毅%週韶霞
리홍붕%구해파%허덕의%류령%왕련%정혜민%양의%주소하
人肺微血管内皮细胞%血管紧张素Ⅱ 1型受体%脂多糖%放射配体结合分析法
人肺微血管內皮細胞%血管緊張素Ⅱ 1型受體%脂多糖%放射配體結閤分析法
인폐미혈관내피세포%혈관긴장소Ⅱ 1형수체%지다당%방사배체결합분석법
目的 建立一种脂多糖(LPS)刺激下人肺微血管内皮细胞(HPMEC)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型受体(ATR1)与其配体AngⅡ结合的放射配体结合分析法(RLBA).方法 体外培养的HPMEC接种于24孔培养板,当细胞达到80%～90%融合,饥饿24 h后用浓度为100 ng/ml的LPS刺激8 h,用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 fmol 8个不同剂量的放射性配体125I-AngⅡ(TL表示其放射性)在板孔中与ATR1结合 (存在或不存在5 μg AngⅡ),然后γ计数仪计数,测定ATR1的总结合 (TB) 与非特异性结合 (NSB),TL减去TB得游离放射配体 (F),TB减去NSB得ATR1的特异性结合 (B).由TB与TL作图得ATR1饱和曲线;由B/F与B作图得出Scatchart曲线.结果 随放射性配体125I-AngⅡ加入量的增加,NSB也相应逐渐增加,且由直线相关与回归分析得到NSB与加入125I-AngⅡ剂量呈直线关系(r2=0.9929);Scatchart作图得B/F与B也呈直线关系,其相关系数r2=0.9514.HPMEC上仅存在单一亲和力的AngⅡ受体,反应亲和力的Kd值为109 pmol/5×105细胞,从Scatchart曲线与X轴截距得到ATR1的最大结合位点Bmax为29 pmol/5×105细胞;ATR1饱和曲线分为两段,前段斜率较大,随125I-AngⅡ加入量的增加TB增加明显;后端曲线较为平坦,TB随125I-AngⅡ的增加变化不明显,125I-AngⅡ在1600 pmol/5×105细胞与2000 pmol/5×105细胞之间TB的增加与NBS增加基本相当,能使ATR1饱和的125I-AngⅡ剂量为1600 pmol/5×105细胞.结论 本实验建立的RLBA方法能得到ATR1的Kd与Bmax两个基本参数,可用于LPS刺激下HPMEC的ATR1功能研究.
目的 建立一種脂多糖(LPS)刺激下人肺微血管內皮細胞(HPMEC)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)1型受體(ATR1)與其配體AngⅡ結閤的放射配體結閤分析法(RLBA).方法 體外培養的HPMEC接種于24孔培養闆,噹細胞達到80%～90%融閤,饑餓24 h後用濃度為100 ng/ml的LPS刺激8 h,用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 fmol 8箇不同劑量的放射性配體125I-AngⅡ(TL錶示其放射性)在闆孔中與ATR1結閤 (存在或不存在5 μg AngⅡ),然後γ計數儀計數,測定ATR1的總結閤 (TB) 與非特異性結閤 (NSB),TL減去TB得遊離放射配體 (F),TB減去NSB得ATR1的特異性結閤 (B).由TB與TL作圖得ATR1飽和麯線;由B/F與B作圖得齣Scatchart麯線.結果 隨放射性配體125I-AngⅡ加入量的增加,NSB也相應逐漸增加,且由直線相關與迴歸分析得到NSB與加入125I-AngⅡ劑量呈直線關繫(r2=0.9929);Scatchart作圖得B/F與B也呈直線關繫,其相關繫數r2=0.9514.HPMEC上僅存在單一親和力的AngⅡ受體,反應親和力的Kd值為109 pmol/5×105細胞,從Scatchart麯線與X軸截距得到ATR1的最大結閤位點Bmax為29 pmol/5×105細胞;ATR1飽和麯線分為兩段,前段斜率較大,隨125I-AngⅡ加入量的增加TB增加明顯;後耑麯線較為平坦,TB隨125I-AngⅡ的增加變化不明顯,125I-AngⅡ在1600 pmol/5×105細胞與2000 pmol/5×105細胞之間TB的增加與NBS增加基本相噹,能使ATR1飽和的125I-AngⅡ劑量為1600 pmol/5×105細胞.結論 本實驗建立的RLBA方法能得到ATR1的Kd與Bmax兩箇基本參數,可用于LPS刺激下HPMEC的ATR1功能研究.
목적 건립일충지다당(LPS)자격하인폐미혈관내피세포(HPMEC)혈관긴장소Ⅱ(AngⅡ)1형수체(ATR1)여기배체AngⅡ결합적방사배체결합분석법(RLBA).방법 체외배양적HPMEC접충우24공배양판,당세포체도80%～90%융합,기아24 h후용농도위100 ng/ml적LPS자격8 h,용0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 fmol 8개불동제량적방사성배체125I-AngⅡ(TL표시기방사성)재판공중여ATR1결합 (존재혹불존재5 μg AngⅡ),연후γ계수의계수,측정ATR1적총결합 (TB) 여비특이성결합 (NSB),TL감거TB득유리방사배체 (F),TB감거NSB득ATR1적특이성결합 (B).유TB여TL작도득ATR1포화곡선;유B/F여B작도득출Scatchart곡선.결과 수방사성배체125I-AngⅡ가입량적증가,NSB야상응축점증가,차유직선상관여회귀분석득도NSB여가입125I-AngⅡ제량정직선관계(r2=0.9929);Scatchart작도득B/F여B야정직선관계,기상관계수r2=0.9514.HPMEC상부존재단일친화력적AngⅡ수체,반응친화력적Kd치위109 pmol/5×105세포,종Scatchart곡선여X축절거득도ATR1적최대결합위점Bmax위29 pmol/5×105세포;ATR1포화곡선분위량단,전단사솔교대,수125I-AngⅡ가입량적증가TB증가명현;후단곡선교위평탄,TB수125I-AngⅡ적증가변화불명현,125I-AngⅡ재1600 pmol/5×105세포여2000 pmol/5×105세포지간TB적증가여NBS증가기본상당,능사ATR1포화적125I-AngⅡ제량위1600 pmol/5×105세포.결론 본실험건립적RLBA방법능득도ATR1적Kd여Bmax량개기본삼수,가용우LPS자격하HPMEC적ATR1공능연구.
