CAJ | 학술논문

adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件.
adiponectin시지방세포특이분비적일충활성단백질,구유증가이도소민감성、항염급항동맥경화등활성.건립adiponectin기인척제β-반유당감매기인(LacZ)고입소서모형,가위정체동물수평연구adiponectin기인공능급기표체조공궤제등제공이상공구.근거생물신식학방법획득adiponectin기인조서렬,설계기인척제급고입책략,재adiponectin기인제2화제3호외현자척제적동시,재기ATG화신호태서렬후순접LacZ기인완정편마서렬,구건완성료Adipo-LacZ-XpPNT기인척제질립.통과전천공장타파질립전입ES세포,이G418화ganciclovir진행약물사선,획득약물항성적ES세포극륭,PCR화DNA인적감정출정학동원중조극륭.장동원중조적ES세포극륭주입소서낭배득도감합체소서,감합체소서여C57BL/6J소서교배산생잡합자소서,잡합자간교배획득adiponectin기인척제LacZ기인고입순합자소서.경RT-PCR、RNA인적화ELISA검측증실순합자소서지방화혈청중adiponectin기인표체정음성.RT-PCR、RNA인적급단백질인적검측발현,LacZ기인재돌변소서지방조직중유특이성표체,기표체보여내원성adiponectin기인적표체보일치.단재지방조직급외주혈중미능검측도LacZ활성,차혈청중LacZ단백역정음성.유차성공건립료adiponectin기인완전멸활급LacZ기인이내원성adiponectin기인표체보표체적소서모형,위진일보연구해기인공능급기표체조공창조료유리조건.