生物技术通讯
生物技術通訊
생물기술통신
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
2008年
3期
340-343
,共4页
孙宝昌%靳宝峰%梁冰%李爱玲%钭慧芬%陈栋%周涛
孫寶昌%靳寶峰%樑冰%李愛玲%鈄慧芬%陳棟%週濤
손보창%근보봉%량빙%리애령%두혜분%진동%주도
RNA干扰%p53基因%载体介导
RNA榦擾%p53基因%載體介導
RNA간우%p53기인%재체개도
目的:筛选有效抑制p53基因表达的靶位点,以研究其在哺乳动物细胞中的功能.方法:用Ambion公司的RNA干扰(RNAi)设计软件设计了3段针对野生型p53基因的长度为19 nt的反向重复序列,在人工退火条件下形成双链,将其构建到pSilencer3.1-H1 neo载体上,与pcDNA3.1-HA-p53(野生型)载体共转染Cos7及293T细胞,用Western blot检测HA-p53蛋白质的表达;将pCMV-GFP-p53与p53-RNAi或空载体共转入Cos7细胞,于激光扫描共聚焦显微镜下比较GFP-p53的表达;将p53-RNAi和空载体分别转入BEL-7405-p53-RE-luc+细胞,在不同剂量化疗药物阿霉素的作用下,通过活体成像仪观察内源p53的表达;利用G418(neo)筛选获得稳定整合p53-RNAi的H460细胞(p53野生型)株,用流式细胞仪分析正常及p53基因沉默细胞的周期变化.结果:筛选到一个有效的p53基因沉默位点,并在H460细胞中得到p53基因沉默的稳定细胞株.结论:获得了有效的p53基因RNAi位点,为进一步研究p53基因在细胞中的功能提供了有力的工具.
目的:篩選有效抑製p53基因錶達的靶位點,以研究其在哺乳動物細胞中的功能.方法:用Ambion公司的RNA榦擾(RNAi)設計軟件設計瞭3段針對野生型p53基因的長度為19 nt的反嚮重複序列,在人工退火條件下形成雙鏈,將其構建到pSilencer3.1-H1 neo載體上,與pcDNA3.1-HA-p53(野生型)載體共轉染Cos7及293T細胞,用Western blot檢測HA-p53蛋白質的錶達;將pCMV-GFP-p53與p53-RNAi或空載體共轉入Cos7細胞,于激光掃描共聚焦顯微鏡下比較GFP-p53的錶達;將p53-RNAi和空載體分彆轉入BEL-7405-p53-RE-luc+細胞,在不同劑量化療藥物阿黴素的作用下,通過活體成像儀觀察內源p53的錶達;利用G418(neo)篩選穫得穩定整閤p53-RNAi的H460細胞(p53野生型)株,用流式細胞儀分析正常及p53基因沉默細胞的週期變化.結果:篩選到一箇有效的p53基因沉默位點,併在H460細胞中得到p53基因沉默的穩定細胞株.結論:穫得瞭有效的p53基因RNAi位點,為進一步研究p53基因在細胞中的功能提供瞭有力的工具.
목적:사선유효억제p53기인표체적파위점,이연구기재포유동물세포중적공능.방법:용Ambion공사적RNA간우(RNAi)설계연건설계료3단침대야생형p53기인적장도위19 nt적반향중복서렬,재인공퇴화조건하형성쌍련,장기구건도pSilencer3.1-H1 neo재체상,여pcDNA3.1-HA-p53(야생형)재체공전염Cos7급293T세포,용Western blot검측HA-p53단백질적표체;장pCMV-GFP-p53여p53-RNAi혹공재체공전입Cos7세포,우격광소묘공취초현미경하비교GFP-p53적표체;장p53-RNAi화공재체분별전입BEL-7405-p53-RE-luc+세포,재불동제양화료약물아매소적작용하,통과활체성상의관찰내원p53적표체;이용G418(neo)사선획득은정정합p53-RNAi적H460세포(p53야생형)주,용류식세포의분석정상급p53기인침묵세포적주기변화.결과:사선도일개유효적p53기인침묵위점,병재H460세포중득도p53기인침묵적은정세포주.결론:획득료유효적p53기인RNAi위점,위진일보연구p53기인재세포중적공능제공료유력적공구.
