安徽医科大学学报
安徽醫科大學學報
안휘의과대학학보
ACTA UNIVERSITY MEDICINALIS ANHUI
2012年
10期
1147-1151
,共5页
王彦梅%何家才%邹多宏%朱思姮
王彥梅%何傢纔%鄒多宏%硃思姮
왕언매%하가재%추다굉%주사항
低氧诱导因子-1α%基因突变%慢病毒载体%抗降解作用
低氧誘導因子-1α%基因突變%慢病毒載體%抗降解作用
저양유도인자-1α%기인돌변%만병독재체%항강해작용
目的 构建点突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)慢病毒载体,并检测其在常氧条件下的抗降解作用.方法 根据人的HIF-1α基因(NM_001530),对其全长编码区序列进行如下定点突变:803位天冬酰胺突变成丙氨酸,564位脯氨酸突变成丙氨酸,402位脯氨酸突变成丙氨酸.设计并合成3对引物用以导入变异点.PCR扩增序列片段,然后将目的 基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.PacI和AscI酶切鉴定后,用LR重组系统将目的 序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-MT(突变型HIF-1α)及Lenti-WT(野生型HIF-1α).将Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ(对照组)转染293T细胞后,采用qPCR检测目的 基因的表达.转染后的细胞在低氧条件下(2% O2)培养48 h,然后常氧条件下培养48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白在不同氧浓度条件下的表达情况.结果 与WT测序结果对比表明MT已被完成.酶切结果证明已成功构建pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.qPCR结果显示Lenti-MT组目的 基因表达高于Lenti-WT组,且差异具有统计学意义.低氧条件下,HIF-1α在WT组和MT组中的蛋白表达差异无统计学意义.但常氧条件下培养48 h后,WT组目的 蛋白的表达显著下降,而MT组变化不大.上述结果表明MT具有明显的抗降解作用.结论 成功构建了突变型HIF-1α,慢病毒载体在常氧条件下,Lenti-MT具有显著的抗降解作用.
目的 構建點突變型低氧誘導因子-1α(HIF-1α)慢病毒載體,併檢測其在常氧條件下的抗降解作用.方法 根據人的HIF-1α基因(NM_001530),對其全長編碼區序列進行如下定點突變:803位天鼕酰胺突變成丙氨痠,564位脯氨痠突變成丙氨痠,402位脯氨痠突變成丙氨痠.設計併閤成3對引物用以導入變異點.PCR擴增序列片段,然後將目的 基因PCR產物連接到載體pEGFP-N1上,構建真覈錶達載體pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.PacI和AscI酶切鑒定後,用LR重組繫統將目的 序列重組到慢病毒載體plenti6.3V5-DEST上,構建慢病毒載體Lenti-MT(突變型HIF-1α)及Lenti-WT(野生型HIF-1α).將Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ(對照組)轉染293T細胞後,採用qPCR檢測目的 基因的錶達.轉染後的細胞在低氧條件下(2% O2)培養48 h,然後常氧條件下培養48 h,採用Western blot檢測HIF-1α蛋白在不同氧濃度條件下的錶達情況.結果 與WT測序結果對比錶明MT已被完成.酶切結果證明已成功構建pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.qPCR結果顯示Lenti-MT組目的 基因錶達高于Lenti-WT組,且差異具有統計學意義.低氧條件下,HIF-1α在WT組和MT組中的蛋白錶達差異無統計學意義.但常氧條件下培養48 h後,WT組目的 蛋白的錶達顯著下降,而MT組變化不大.上述結果錶明MT具有明顯的抗降解作用.結論 成功構建瞭突變型HIF-1α,慢病毒載體在常氧條件下,Lenti-MT具有顯著的抗降解作用.
목적 구건점돌변형저양유도인자-1α(HIF-1α)만병독재체,병검측기재상양조건하적항강해작용.방법 근거인적HIF-1α기인(NM_001530),대기전장편마구서렬진행여하정점돌변:803위천동선알돌변성병안산,564위포안산돌변성병안산,402위포안산돌변성병안산.설계병합성3대인물용이도입변이점.PCR확증서렬편단,연후장목적 기인PCR산물련접도재체pEGFP-N1상,구건진핵표체재체pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.PacI화AscI매절감정후,용LR중조계통장목적 서렬중조도만병독재체plenti6.3V5-DEST상,구건만병독재체Lenti-MT(돌변형HIF-1α)급Lenti-WT(야생형HIF-1α).장Lenti-MT、Lenti-WT급Lenti-LacZ(대조조)전염293T세포후,채용qPCR검측목적 기인적표체.전염후적세포재저양조건하(2% O2)배양48 h,연후상양조건하배양48 h,채용Western blot검측HIF-1α단백재불동양농도조건하적표체정황.결과 여WT측서결과대비표명MT이피완성.매절결과증명이성공구건pEGFP-N1-mutant/HIF-1α.qPCR결과현시Lenti-MT조목적 기인표체고우Lenti-WT조,차차이구유통계학의의.저양조건하,HIF-1α재WT조화MT조중적단백표체차이무통계학의의.단상양조건하배양48 h후,WT조목적 단백적표체현저하강,이MT조변화불대.상술결과표명MT구유명현적항강해작용.결론 성공구건료돌변형HIF-1α,만병독재체재상양조건하,Lenti-MT구유현저적항강해작용.
