浙江大学学报(医学版)
浙江大學學報(醫學版)
절강대학학보(의학판)
JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2010年
3期
311-317
,共7页
孙智慧%韩杰%邵蕾%王利宏%宋俊贤%魏钟海%郑良荣
孫智慧%韓傑%邵蕾%王利宏%宋俊賢%魏鐘海%鄭良榮
손지혜%한걸%소뢰%왕리굉%송준현%위종해%정량영
降钙素基因相关肽%重组,遗传%腺病毒科/遗传学%遗传载体%基因表达%基因疗法%心肌/细胞学
降鈣素基因相關肽%重組,遺傳%腺病毒科/遺傳學%遺傳載體%基因錶達%基因療法%心肌/細胞學
강개소기인상관태%중조,유전%선병독과/유전학%유전재체%기인표체%기인요법%심기/세포학
目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.
目的:利用AdEasy腺病毒載體繫統,構建小鼠降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重組腺病毒載體,併驗證其在心肌細胞中的錶達.方法:採用RT-PCR方法擴增齣含有小鼠CGRP全長cDNA的基因片段,併將其插入PUC57載體,經EcoRⅤ和SalⅠ雙酶切,將小鼠CGRP基因亞剋隆至穿梭質粒pShuttle-CMV,形成重組質粒pShuttle-CMV-CGRP.經PmeⅠ酶切線性化後,在大腸桿菌BJ5183中與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1同源重組產生重組腺病毒質粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重組腺病毒質粒在XL-Gold 細胞中擴增,經PacⅠ酶切線性化後,轉染人胚腎293細胞進行重組腺病毒的包裝,併經氯化銫純化得到重組腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用純化後的重組腺病毒轉染原代培養的乳鼠心肌細胞,熒光顯微鏡下觀察轉染效果.通過尾靜脈導入重組腺病毒7 d後,放免法測定心肌中CGRP的錶達量.結果:測序證實PUC57 -CGRP重組質粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重組穿梭質粒pShuttle-CMV-CGRP經雙酶切鑒定後可見約7.5 kb和423 bp片段;重組腺病毒質粒AdEasy-pShuttle-CGRP經Pac Ⅰ酶切可見長約3 kb與30 kb DNA片斷.轉染293細胞進行包裝,7 d後細胞齣現病變效應,迴收病毒重複感染293細胞,在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白錶達.提取病變293細胞中重組腺病毒進行目的基因的PCR鑒定為暘性.構建好的重組腺病毒經純化後具有很高的滴度,併且成功轉染瞭原代培養的乳鼠心肌細胞.通過放免法證實,該載體可以顯著增加小鼠心髒中CGRP的錶達.結論:成功構建攜帶CGRP基因的重組腺病毒載體,該重組腺病毒載體AV-CGRP可以顯著增加心髒中CGRP的錶達量,為進一步研究CGRP基因治療奠定瞭基礎.
목적:이용AdEasy선병독재체계통,구건소서강개소기인상관태(calcitonin gene-related peptide,CGRP)기인중조선병독재체,병험증기재심기세포중적표체.방법:채용RT-PCR방법확증출함유소서CGRP전장cDNA적기인편단,병장기삽입PUC57재체,경EcoRⅤ화SalⅠ쌍매절,장소서CGRP기인아극륭지천사질립pShuttle-CMV,형성중조질립pShuttle-CMV-CGRP.경PmeⅠ매절선성화후,재대장간균BJ5183중여선병독골가질립pAdEasy-1동원중조산생중조선병독질립AdEasy-pShuttle-CGRP.중조선병독질립재XL-Gold 세포중확증,경PacⅠ매절선성화후,전염인배신293세포진행중조선병독적포장,병경록화색순화득도중조선병독AdEasy-pShuttle-CGRP.용순화후적중조선병독전염원대배양적유서심기세포,형광현미경하관찰전염효과.통과미정맥도입중조선병독7 d후,방면법측정심기중CGRP적표체량.결과:측서증실PUC57 -CGRP중조질립중함유소서CGRP기인적cDNA;중조천사질립pShuttle-CMV-CGRP경쌍매절감정후가견약7.5 kb화423 bp편단;중조선병독질립AdEasy-pShuttle-CGRP경Pac Ⅰ매절가견장약3 kb여30 kb DNA편단.전염293세포진행포장,7 d후세포출현병변효응,회수병독중복감염293세포,재형광현미경하가견록색형광단백표체.제취병변293세포중중조선병독진행목적기인적PCR감정위양성.구건호적중조선병독경순화후구유흔고적적도,병차성공전염료원대배양적유서심기세포.통과방면법증실,해재체가이현저증가소서심장중CGRP적표체.결론:성공구건휴대CGRP기인적중조선병독재체,해중조선병독재체AV-CGRP가이현저증가심장중CGRP적표체량,위진일보연구CGRP기인치료전정료기출.
