畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2012年
3期
489-495
,共7页
朱江江%罗军%王紫骞%许会芬%孙雨婷%石恒波%郝娟%赵丽媛
硃江江%囉軍%王紫鶱%許會芬%孫雨婷%石恆波%郝娟%趙麗媛
주강강%라군%왕자건%허회분%손우정%석항파%학연%조려원
奶山羊%乙酰/丙二酸单酰基转移酶%重组腺病毒
奶山羊%乙酰/丙二痠單酰基轉移酶%重組腺病毒
내산양%을선/병이산단선기전이매%중조선병독
本研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因乙酰/丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重组腺病毒载体,为研究其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达以及功能和作用机制做准备.根据GenBank收录的西农萨能羊MAT序列设计引物,PCR扩增并克隆测序.将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上并线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy Ⅰ的Ecoli Bj5183感受态细胞进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAdMAT-HIS,并用Pac Ⅰ酶切鉴定,将经过Pac Ⅰ线性化的pAd-MAT-HIS转染HEK 293细胞进行病毒包装和扩增,用LaSRT法测定病毒滴度.将本次克隆的MAT序列与GenBank收录的山羊序列对比发现,在601 bp处碱基由G转变为A,导致氨基酸序列由丙氨酸(Ala)201转变为苏氨酸(Thr) 201.酶切鉴定、绿色荧光蛋白观察、PCR及Western blot检测均证明,重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为2×109 PFU·mL-1.本研究成功构建了重组腺病毒pAdEasy-MAT-HIS.
本研究旨在通過構建西農薩能羊脂肪痠閤酶(FASN)基因乙酰/丙二痠單酰基轉移酶(MAT)區域的重組腺病毒載體,為研究其在奶山羊乳腺上皮細胞中過錶達以及功能和作用機製做準備.根據GenBank收錄的西農薩能羊MAT序列設計引物,PCR擴增併剋隆測序.將目的基因連接到穿梭載體pAdTrack/CMV上併線性化後,轉化含有腺病毒骨架載體pAdEasy Ⅰ的Ecoli Bj5183感受態細胞進行同源重組,得到重組腺病毒質粒pAdMAT-HIS,併用Pac Ⅰ酶切鑒定,將經過Pac Ⅰ線性化的pAd-MAT-HIS轉染HEK 293細胞進行病毒包裝和擴增,用LaSRT法測定病毒滴度.將本次剋隆的MAT序列與GenBank收錄的山羊序列對比髮現,在601 bp處堿基由G轉變為A,導緻氨基痠序列由丙氨痠(Ala)201轉變為囌氨痠(Thr) 201.酶切鑒定、綠色熒光蛋白觀察、PCR及Western blot檢測均證明,重組腺病毒質粒構建成功,病毒滴度為2×109 PFU·mL-1.本研究成功構建瞭重組腺病毒pAdEasy-MAT-HIS.
본연구지재통과구건서농살능양지방산합매(FASN)기인을선/병이산단선기전이매(MAT)구역적중조선병독재체,위연구기재내산양유선상피세포중과표체이급공능화작용궤제주준비.근거GenBank수록적서농살능양MAT서렬설계인물,PCR확증병극륭측서.장목적기인련접도천사재체pAdTrack/CMV상병선성화후,전화함유선병독골가재체pAdEasy Ⅰ적Ecoli Bj5183감수태세포진행동원중조,득도중조선병독질립pAdMAT-HIS,병용Pac Ⅰ매절감정,장경과Pac Ⅰ선성화적pAd-MAT-HIS전염HEK 293세포진행병독포장화확증,용LaSRT법측정병독적도.장본차극륭적MAT서렬여GenBank수록적산양서렬대비발현,재601 bp처감기유G전변위A,도치안기산서렬유병안산(Ala)201전변위소안산(Thr) 201.매절감정、록색형광단백관찰、PCR급Western blot검측균증명,중조선병독질립구건성공,병독적도위2×109 PFU·mL-1.본연구성공구건료중조선병독pAdEasy-MAT-HIS.
