CAJ | 학술논문

目的构建携带多肿瘤抑制基因p16(mts-1)及抑癌基因p21WAF1的腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装、纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础.方法以p16 cDNA及p21 cDNA 全长为目的基因,构建AAV载体prAAV-AFP-p16,prAAV-AFP-p21,prAAV-CMV-p16及prAAV-CMV-p21.其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因.应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞,2 d后感染野生型腺病毒,至细胞裂解病变明显时收获.纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子 DNA,进行病毒DNA颗粒滴度测定.然后用重组腺相关病毒与腺病毒(MOI均为10)共感染C12细胞,至细胞裂解病变明显时再收获.结果重组载体经酶切鉴定测序证实.293细胞、C12细胞包装病毒效果良好,病毒颗粒滴度介于1013～1014个/ml之间.携带GFP的感染性AAV滴度为5×1010个/ml.电镜下病毒呈小圆形空斑状,直径25～30 nm.MOI值100时,rAAV-AFP-GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达70%,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标.结论成功构建了AAV载体,探讨了病毒包装方法,即第一次转染成功后,再经过反复感染收获,重组病毒得到稳定扩增,方法简便,获得了大量高纯度的重组AAV病毒.
목적구건휴대다종류억제기인p16(mts-1)급억암기인p21WAF1적선상관병독(AAV)재체,통과병독포장、순화급적정,획득고순도고감염성적병독액,위진행간암기인치료적실험연구전정기출.방법이p16 cDNA급p21 cDNA 전장위목적기인,구건AAV재체prAAV-AFP-p16,prAAV-AFP-p21,prAAV-CMV-p16급prAAV-CMV-p21.기중전량충재체능재인간암세포중특이표체목적기인.응용지질체장중조재체여보조질립PspRC72、선병독점립공전염포장세포,2 d후감염야생형선병독,지세포렬해병변명현시수획.순화후용취합매련반응법확증배비희석후병독액내적갑태구단백혹거세포병독계동자 DNA,진행병독DNA과립적도측정.연후용중조선상관병독여선병독(MOI균위10)공감염C12세포,지세포렬해병변명현시재수획.결과중조재체경매절감정측서증실.293세포、C12세포포장병독효과량호,병독과립적도개우1013～1014개/ml지간.휴대GFP적감염성AAV적도위5×1010개/ml.전경하병독정소원형공반상,직경25～30 nm.MOI치100시,rAAV-AFP-GFP병독감염간암세포적양성솔체70%,위휴대목적기인적AAV병독용우간암세포적촉조망연구제공료정량지표.결론성공구건료AAV재체,탐토료병독포장방법,즉제일차전염성공후,재경과반복감염수획,중조병독득도은정확증,방법간편,획득료대량고순도적중조AAV병독.