CAJ | 학술논문

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株.方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序.在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定.以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株.结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功.RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达.结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株.
목적:구건함인야생형급치병돌변A30P、A53TSNCA기인적중조진핵표체재체pEGFP-C3-SNCA,병통과은정전염획득과표체인야생형급치병돌변A30P、A53T α-synuclein(SNCA)적단극륭PC12세포주.방법:통과RT-PCR방법확증SNCA기인,T-A극륭후측서.재차기출상이용단핵감산차이인물정점유변법상계구건함SNCA기인편마구EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ량매절위점적동의돌변급기치병돌변G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)적중조진핵표체재체pEGFP-C3-SNCA,병이PCR、쌍매절、측서감정.이중조질립pEGFP-C3-SNCA통과지질체전염방법전염PC12세포;이G418진행사선;이유한희석법진행아극륭획득은정과표체인야생형급치병돌변A30P、A53T α-synuclein적단극륭PC12세포주,병이은정전염pEGFP-C3적PC12세포작위대조조세포,통과RT-PCR、Western blot급형광현미경감정각단극륭PC12세포주.결과:PCR、매절급측서증명중조진핵표체재체pEGFP-C3-SNCA구건성공.RT-PCR、Western blot급형광현미경학인목적기인서렬재PC12세포은정과표체.결론:성공지구건SNCA기인WT급A30P여A53T돌변형적중조진핵표체재체pEGFP-C3-SNCA;성공획득과표체인야생형급치병돌변A30P、A53T α-synuclein적단극륭PC12세포주.