生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2007年
5期
852-857
,共6页
吴楚%答亮%陈光明%张芳%赵慕钧
吳楚%答亮%陳光明%張芳%趙慕鈞
오초%답량%진광명%장방%조모균
LPTS-L蛋白%磷酸纤维素P11%表达纯化
LPTS-L蛋白%燐痠纖維素P11%錶達純化
LPTS-L단백%린산섬유소P11%표체순화
LPTS基因是利用定位候选克隆策略克隆的一个新的肝相关候选肿瘤抑制基因.LPTS基因编码一个全长为328氨基酸的蛋白质(LPTS-L),该蛋白具有抑制细胞端粒酶活性的功能.为了进一步研究LPTS-L蛋白的结构与功能,利用DNA重组技术,将LPTS-L的cDNA克隆到表达载体pET-24a中构建重组克隆pET-24-LPTS,并在大肠杆菌BL-21中进行融合表达,获得可溶形式的LPTS-L融合蛋白.采用Ni Sepharose 4B柱亲和层析,可以获得纯度较高的蛋白,但不适合大量制备.通过设计引物去掉了pET-24a载体上的6×His tag将LPTS-L基因进行了非融合表达,然后采用磷酸纤维素P11阳离子交换层析纯化LPTS-L蛋白,纯度可达到55%.再经Sephadex G-100凝胶过滤,LPTS-L蛋白的纯度可达到80%.Western blot实验显示经纯化后的LPTS-L蛋白可与兔抗GST-LPTS-L的多抗发生特异性结合.采用TRAP法测定蛋白质活性,结果显示纯化得到的LPTS-L蛋白可抑制端粒酶的活性,与采用Ni Sepharose 4B纯化获得的LPTS-L融合蛋白比较,其抑制效率基本一致.因此,所建立的技术可以有效地制备LPTS-L蛋白.
LPTS基因是利用定位候選剋隆策略剋隆的一箇新的肝相關候選腫瘤抑製基因.LPTS基因編碼一箇全長為328氨基痠的蛋白質(LPTS-L),該蛋白具有抑製細胞耑粒酶活性的功能.為瞭進一步研究LPTS-L蛋白的結構與功能,利用DNA重組技術,將LPTS-L的cDNA剋隆到錶達載體pET-24a中構建重組剋隆pET-24-LPTS,併在大腸桿菌BL-21中進行融閤錶達,穫得可溶形式的LPTS-L融閤蛋白.採用Ni Sepharose 4B柱親和層析,可以穫得純度較高的蛋白,但不適閤大量製備.通過設計引物去掉瞭pET-24a載體上的6×His tag將LPTS-L基因進行瞭非融閤錶達,然後採用燐痠纖維素P11暘離子交換層析純化LPTS-L蛋白,純度可達到55%.再經Sephadex G-100凝膠過濾,LPTS-L蛋白的純度可達到80%.Western blot實驗顯示經純化後的LPTS-L蛋白可與兔抗GST-LPTS-L的多抗髮生特異性結閤.採用TRAP法測定蛋白質活性,結果顯示純化得到的LPTS-L蛋白可抑製耑粒酶的活性,與採用Ni Sepharose 4B純化穫得的LPTS-L融閤蛋白比較,其抑製效率基本一緻.因此,所建立的技術可以有效地製備LPTS-L蛋白.
LPTS기인시이용정위후선극륭책략극륭적일개신적간상관후선종류억제기인.LPTS기인편마일개전장위328안기산적단백질(LPTS-L),해단백구유억제세포단립매활성적공능.위료진일보연구LPTS-L단백적결구여공능,이용DNA중조기술,장LPTS-L적cDNA극륭도표체재체pET-24a중구건중조극륭pET-24-LPTS,병재대장간균BL-21중진행융합표체,획득가용형식적LPTS-L융합단백.채용Ni Sepharose 4B주친화층석,가이획득순도교고적단백,단불괄합대량제비.통과설계인물거도료pET-24a재체상적6×His tag장LPTS-L기인진행료비융합표체,연후채용린산섬유소P11양리자교환층석순화LPTS-L단백,순도가체도55%.재경Sephadex G-100응효과려,LPTS-L단백적순도가체도80%.Western blot실험현시경순화후적LPTS-L단백가여토항GST-LPTS-L적다항발생특이성결합.채용TRAP법측정단백질활성,결과현시순화득도적LPTS-L단백가억제단립매적활성,여채용Ni Sepharose 4B순화획득적LPTS-L융합단백비교,기억제효솔기본일치.인차,소건립적기술가이유효지제비LPTS-L단백.
