中国肿瘤生物治疗杂志
中國腫瘤生物治療雜誌
중국종류생물치료잡지
CHINESE JOURNAL OF CANCER BIOTHERAPY
2007年
4期
317-321
,共5页
蒋华蔚%任秀宝%于津浦%李慧%曹水
蔣華蔚%任秀寶%于津浦%李慧%曹水
장화위%임수보%우진포%리혜%조수
可溶性CD40配体%CHO细胞%绿色荧光蛋白%凋亡%Fas
可溶性CD40配體%CHO細胞%綠色熒光蛋白%凋亡%Fas
가용성CD40배체%CHO세포%록색형광단백%조망%Fas
目的: 建立稳定表达sCD40L的CHO细胞系.方法:从含sCD40L的载体pDC316-sCD40L中,将sCD40L编码序列克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP,获得重组质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,酶切及测序鉴定.电穿孔转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆,有限稀释法获取单克隆后扩大培养.流式细胞术、倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;使用PCR、RT-PCR、ELISA方法分别从DNA、mRNA、蛋白水平对sCD40L的表达进行检测.Western blotting检测CHO-sCD40L分泌的sCD40L与膜型CD40的结合;将CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共孵育24 h后,流式细胞术检测MDA-MB-231细胞表面分子Fas的表达变化;加入Fas激活性抗体(CH-11)后观察 MDA-MB-231细胞的凋亡.结果:成功构建质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,转染CHO细胞后经克隆化培养获得稳定表达sCD40L的细胞系CHO-sCD40L.流式细胞术、倒置荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达高达90%以上;PCR检测证实sCD40L基因整合入细胞基因组DNA;RT-PCR检测到sCD40L mRNA的转录;ELISA法检测到细胞培养上清中有sCD40L蛋白表达,高达(4.5±2.1)ng/ml.Western blotting证实CHO-sCD40L分泌的sCD40L可与膜型CD40结合.CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共培养后,MDA-MB-231细胞表面Fas表达由(3.0±1.02)%升高到(34.8±8.75)%;加入CH-11 24 h后,凋亡率由(5.4±1.32)%提高到(20.7±5.24)% (P＜0.01).结论:成功获得稳定表达sCD40L的CHO细胞系,为研究CD40/CD40L途径在肿瘤免疫治疗中的应用提供了有用的工具.
目的: 建立穩定錶達sCD40L的CHO細胞繫.方法:從含sCD40L的載體pDC316-sCD40L中,將sCD40L編碼序列剋隆入真覈錶達載體pIRES2-EGFP,穫得重組質粒pIRES2-EGFP-sCD40L,酶切及測序鑒定.電穿孔轉染CHO細胞,G418篩選抗性剋隆,有限稀釋法穫取單剋隆後擴大培養.流式細胞術、倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的錶達;使用PCR、RT-PCR、ELISA方法分彆從DNA、mRNA、蛋白水平對sCD40L的錶達進行檢測.Western blotting檢測CHO-sCD40L分泌的sCD40L與膜型CD40的結閤;將CHO-sCD40L與MDA-MB-231細胞共孵育24 h後,流式細胞術檢測MDA-MB-231細胞錶麵分子Fas的錶達變化;加入Fas激活性抗體(CH-11)後觀察 MDA-MB-231細胞的凋亡.結果:成功構建質粒pIRES2-EGFP-sCD40L,轉染CHO細胞後經剋隆化培養穫得穩定錶達sCD40L的細胞繫CHO-sCD40L.流式細胞術、倒置熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白錶達高達90%以上;PCR檢測證實sCD40L基因整閤入細胞基因組DNA;RT-PCR檢測到sCD40L mRNA的轉錄;ELISA法檢測到細胞培養上清中有sCD40L蛋白錶達,高達(4.5±2.1)ng/ml.Western blotting證實CHO-sCD40L分泌的sCD40L可與膜型CD40結閤.CHO-sCD40L與MDA-MB-231細胞共培養後,MDA-MB-231細胞錶麵Fas錶達由(3.0±1.02)%升高到(34.8±8.75)%;加入CH-11 24 h後,凋亡率由(5.4±1.32)%提高到(20.7±5.24)% (P＜0.01).結論:成功穫得穩定錶達sCD40L的CHO細胞繫,為研究CD40/CD40L途徑在腫瘤免疫治療中的應用提供瞭有用的工具.
목적: 건립은정표체sCD40L적CHO세포계.방법:종함sCD40L적재체pDC316-sCD40L중,장sCD40L편마서렬극륭입진핵표체재체pIRES2-EGFP,획득중조질립pIRES2-EGFP-sCD40L,매절급측서감정.전천공전염CHO세포,G418사선항성극륭,유한희석법획취단극륭후확대배양.류식세포술、도치형광현미경관찰록색형광단백적표체;사용PCR、RT-PCR、ELISA방법분별종DNA、mRNA、단백수평대sCD40L적표체진행검측.Western blotting검측CHO-sCD40L분비적sCD40L여막형CD40적결합;장CHO-sCD40L여MDA-MB-231세포공부육24 h후,류식세포술검측MDA-MB-231세포표면분자Fas적표체변화;가입Fas격활성항체(CH-11)후관찰 MDA-MB-231세포적조망.결과:성공구건질립pIRES2-EGFP-sCD40L,전염CHO세포후경극륭화배양획득은정표체sCD40L적세포계CHO-sCD40L.류식세포술、도치형광현미경검측록색형광단백표체고체90%이상;PCR검측증실sCD40L기인정합입세포기인조DNA;RT-PCR검측도sCD40L mRNA적전록;ELISA법검측도세포배양상청중유sCD40L단백표체,고체(4.5±2.1)ng/ml.Western blotting증실CHO-sCD40L분비적sCD40L가여막형CD40결합.CHO-sCD40L여MDA-MB-231세포공배양후,MDA-MB-231세포표면Fas표체유(3.0±1.02)%승고도(34.8±8.75)%;가입CH-11 24 h후,조망솔유(5.4±1.32)%제고도(20.7±5.24)% (P＜0.01).결론:성공획득은정표체sCD40L적CHO세포계,위연구CD40/CD40L도경재종류면역치료중적응용제공료유용적공구.
