遗传学报
遺傳學報
유전학보
ACTA GENETICA SINICA
2001年
10期
964-970
,共7页
李周华%陈三凤%李季伦
李週華%陳三鳳%李季倫
리주화%진삼봉%리계륜
巴西固氮螺菌Yu62%glnB基因%PII。蛋白%GlnB-突变株
巴西固氮螺菌Yu62%glnB基因%PII。蛋白%GlnB-突變株
파서고담라균Yu62%glnB기인%PII。단백%GlnB-돌변주
通过原位杂交从巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中，筛选到glnB基因的阳性克隆，将3.7kb/EcoRI+PstI的阳性克隆亚克隆到pUC19中，进行了全序列分析，其在GenBank中的登记号是AF323960。DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因，glnB基因下游是编码谷氨酰胺合成酶(GS)的glnA基因，glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF。glnB基因编码区长336bp，编码112个氨基酸，与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分别高达71％、77％、79％和69％。将卡那霉素抗性片段(Km-cas-sette)插入glnB基因的BglⅡ位点，通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中，通过同源重组，获得GlnB-突变株(glnB：：Km)。为了进一步分析glnB基因的功能，将glnB基因的编码区(339bp)构建在pVK100中，置于Km启动子下组成型表达，形成重组质粒pVK-Ⅱ。将重组质粒pVK-Ⅱ转入到GlnB-突变株，构建成互补株C-glnB(glnB：：Km/glnB)。对GlnB-突变株和互补株的固氮酶活性和生长性能的测定表明，GlnB-突变体无固氮酶活性，即表型
为Nif-；而互补株像野生型菌株一样具有固氮酶活性。突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同。将含有glnB基因的重组质粒pVK-Ⅱ分别转移到野生型Yu62菌株和具有一定抗铵能力的DraT-突变株中，使glnB基因的拷贝数增加，并进一步比较它们的固氮酶活性，结果表明多拷贝的glnB基因能显著提高固氮酶活性。
通過原位雜交從巴西固氮螺菌Yu62的基因文庫中，篩選到glnB基因的暘性剋隆，將3.7kb/EcoRI+PstI的暘性剋隆亞剋隆到pUC19中，進行瞭全序列分析，其在GenBank中的登記號是AF323960。DNA序列分析錶明該暘性剋隆含有完整的glnB基因，glnB基因下遊是編碼穀氨酰胺閤成酶(GS)的glnA基因，glnB基因上遊是一箇編碼未知蛋白的ORF。glnB基因編碼區長336bp，編碼112箇氨基痠，與肺炎剋氏桿菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大腸桿菌在氨基痠順序的同源性分彆高達71％、77％、79％和69％。將卡那黴素抗性片段(Km-cas-sette)插入glnB基因的BglⅡ位點，通過三親雜交法將其引入到巴西固氮螺菌Yu62中，通過同源重組，穫得GlnB-突變株(glnB：：Km)。為瞭進一步分析glnB基因的功能，將glnB基因的編碼區(339bp)構建在pVK100中，置于Km啟動子下組成型錶達，形成重組質粒pVK-Ⅱ。將重組質粒pVK-Ⅱ轉入到GlnB-突變株，構建成互補株C-glnB(glnB：：Km/glnB)。對GlnB-突變株和互補株的固氮酶活性和生長性能的測定錶明，GlnB-突變體無固氮酶活性，即錶型
為Nif-；而互補株像野生型菌株一樣具有固氮酶活性。突變株、互補株及野生型在菌落生長速度上基本相同。將含有glnB基因的重組質粒pVK-Ⅱ分彆轉移到野生型Yu62菌株和具有一定抗銨能力的DraT-突變株中，使glnB基因的拷貝數增加，併進一步比較它們的固氮酶活性，結果錶明多拷貝的glnB基因能顯著提高固氮酶活性。
통과원위잡교종파서고담라균Yu62적기인문고중，사선도glnB기인적양성극륭，장3.7kb/EcoRI+PstI적양성극륭아극륭도pUC19중，진행료전서렬분석，기재GenBank중적등기호시AF323960。DNA서렬분석표명해양성극륭함유완정적glnB기인，glnB기인하유시편마곡안선알합성매(GS)적glnA기인，glnB기인상유시일개편마미지단백적ORF。glnB기인편마구장336bp，편마112개안기산，여폐염극씨간균、대두만생근류균、완두근류균급대장간균재안기산순서적동원성분별고체71％、77％、79％화69％。장잡나매소항성편단(Km-cas-sette)삽입glnB기인적BglⅡ위점，통과삼친잡교법장기인입도파서고담라균Yu62중，통과동원중조，획득GlnB-돌변주(glnB：：Km)。위료진일보분석glnB기인적공능，장glnB기인적편마구(339bp)구건재pVK100중，치우Km계동자하조성형표체，형성중조질립pVK-Ⅱ。장중조질립pVK-Ⅱ전입도GlnB-돌변주，구건성호보주C-glnB(glnB：：Km/glnB)。대GlnB-돌변주화호보주적고담매활성화생장성능적측정표명，GlnB-돌변체무고담매활성，즉표형
위Nif-；이호보주상야생형균주일양구유고담매활성。돌변주、호보주급야생형재균락생장속도상기본상동。장함유glnB기인적중조질립pVK-Ⅱ분별전이도야생형Yu62균주화구유일정항안능력적DraT-돌변주중，사glnB기인적고패수증가，병진일보비교타문적고담매활성，결과표명다고패적glnB기인능현저제고고담매활성。
