辽宁医学院学报
遼寧醫學院學報
료녕의학원학보
JOURNAL OF LIAONING MEDICAL UNIVERSITY
2009年
5期
392-395,399,477
,共6页
张正%刘丹平%陈峻江%郭韬%张男
張正%劉丹平%陳峻江%郭韜%張男
장정%류단평%진준강%곽도%장남
骨形态发生蛋白2基因%绿色荧光蛋白%腺病毒载体%同源重组%成骨诱导
骨形態髮生蛋白2基因%綠色熒光蛋白%腺病毒載體%同源重組%成骨誘導
골형태발생단백2기인%록색형광단백%선병독재체%동원중조%성골유도
目的 构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的骨形态发生蛋白2(BMP2)目的蛋白和报告分子绿色荧光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核细胞表达载体.方法将去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点Xho Ⅰ的BMP2基因定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1.携带BMP2+基因的重组腺病毒穿梭质粒经酶切鉴定、Pme Ⅰ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1大肠杆菌,利用细菌内同源重组机制将BMP2+和GFP基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒.用Pac Ⅰ酶切去除其质粒成分,暴露腺病毒基因组的反向末端重复序列,转染293细胞,进行腺病毒的包装,完成新型腺病毒载体Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1的构建.作为阳性对照,同时制备多年来广为应用的BMP2腺病毒表达载体Ad CMV-BMP2.以两种载体感染骨髓基质细胞,通过RT-PCR和荧光显微镜分别检测骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白表达情况;通过碱性磷酸酶活性检测判断BMP2诱导成骨分化作用.结果突变后骨形态发生蛋白2基因序列、重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒质粒酶切图谱符合预定设计.感染骨髓基质细胞后,新型腺病毒载体可同时表达报告分子GFP和具有诱导成骨分化活性的BMP2.结论成功构建表达BMP2的新型腺病毒载体.
目的 構建同時錶達具有抗原錶位FLAG標記的骨形態髮生蛋白2(BMP2)目的蛋白和報告分子綠色熒光蛋白(GFP)的新型腺病毒真覈細胞錶達載體.方法將去除翻譯終止密碼子併添加新的酶切識彆位點Xho Ⅰ的BMP2基因定嚮連入腺病毒穿梭質粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1.攜帶BMP2+基因的重組腺病毒穿梭質粒經酶切鑒定、Pme Ⅰ酶切線性化後轉化BJ5183-AD-1大腸桿菌,利用細菌內同源重組機製將BMP2+和GFP基因連同其順勢錶達元件重組入腺病毒基因組質粒.用Pac Ⅰ酶切去除其質粒成分,暴露腺病毒基因組的反嚮末耑重複序列,轉染293細胞,進行腺病毒的包裝,完成新型腺病毒載體Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1的構建.作為暘性對照,同時製備多年來廣為應用的BMP2腺病毒錶達載體Ad CMV-BMP2.以兩種載體感染骨髓基質細胞,通過RT-PCR和熒光顯微鏡分彆檢測骨形態髮生蛋白2和綠色熒光蛋白錶達情況;通過堿性燐痠酶活性檢測判斷BMP2誘導成骨分化作用.結果突變後骨形態髮生蛋白2基因序列、重組腺病毒穿梭質粒和重組腺病毒質粒酶切圖譜符閤預定設計.感染骨髓基質細胞後,新型腺病毒載體可同時錶達報告分子GFP和具有誘導成骨分化活性的BMP2.結論成功構建錶達BMP2的新型腺病毒載體.
목적 구건동시표체구유항원표위FLAG표기적골형태발생단백2(BMP2)목적단백화보고분자록색형광단백(GFP)적신형선병독진핵세포표체재체.방법장거제번역종지밀마자병첨가신적매절식별위점Xho Ⅰ적BMP2기인정향련입선병독천사질립pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1.휴대BMP2+기인적중조선병독천사질립경매절감정、Pme Ⅰ매절선성화후전화BJ5183-AD-1대장간균,이용세균내동원중조궤제장BMP2+화GFP기인련동기순세표체원건중조입선병독기인조질립.용Pac Ⅰ매절거제기질립성분,폭로선병독기인조적반향말단중복서렬,전염293세포,진행선병독적포장,완성신형선병독재체Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1적구건.작위양성대조,동시제비다년래엄위응용적BMP2선병독표체재체Ad CMV-BMP2.이량충재체감염골수기질세포,통과RT-PCR화형광현미경분별검측골형태발생단백2화록색형광단백표체정황;통과감성린산매활성검측판단BMP2유도성골분화작용.결과돌변후골형태발생단백2기인서렬、중조선병독천사질립화중조선병독질립매절도보부합예정설계.감염골수기질세포후,신형선병독재체가동시표체보고분자GFP화구유유도성골분화활성적BMP2.결론성공구건표체BMP2적신형선병독재체.
