CAJ | 학술논문

目的:本研究拟构建针对Pim-3基因的siRNA慢病毒载体,诱导靶细胞中Pim-3基因沉默.方法:分析Pim-3 mRNA序列特征,根据siRNA设计原则,设计并合成特异性针对小鼠Pim-3的siRNA靶DNA序列及阴性对照序列.用限制性核酸内切酶将pGCSIL-GFP载体线性化,将寡DNA片段退火成含有粘性末端的DNA双链后,与慢病毒骨架质粒连接转化至大肠杆菌中进行重组,运用PCR技术筛选阳性克隆并测序,得到pSC-Pim-3 shRNA质粒.采用脂质体将pSC-Pim-3 shRNA质粒和辅助包装质粒共转染到HEK293细胞中包装形成慢病毒.采用倍比稀释法测定慢病毒滴度.慢病毒感染NIH3T3细胞,运用实时定量PCR技术检测Pim-3基因mRNA表达水平,运用蛋白免疫印迹技术检测Pim-3蛋白表达水平.结果:酶切后获得7.5 kb的pGCSIL-GFP片段.DNA片段成功连接到pGCSIL-GFP载体；重组慢病毒的滴度约为2×109 TU/mL.慢病毒能够高效感染靶细胞,并显著抑制内源性Pim-3基因的mRNA(抑制率超过70％)和蛋白(抑制率超过80％)表达.结论:针对Pim-3基因靶序列CCTCTTCGACTTCATCACT的shRNA重组慢病毒能够有效沉默靶细胞Pim-3基因.
목적:본연구의구건침대Pim-3기인적siRNA만병독재체,유도파세포중Pim-3기인침묵.방법:분석Pim-3 mRNA서렬특정,근거siRNA설계원칙,설계병합성특이성침대소서Pim-3적siRNA파DNA서렬급음성대조서렬.용한제성핵산내절매장pGCSIL-GFP재체선성화,장과DNA편단퇴화성함유점성말단적DNA쌍련후,여만병독골가질립련접전화지대장간균중진행중조,운용PCR기술사선양성극륭병측서,득도pSC-Pim-3 shRNA질립.채용지질체장pSC-Pim-3 shRNA질립화보조포장질립공전염도HEK293세포중포장형성만병독.채용배비희석법측정만병독적도.만병독감염NIH3T3세포,운용실시정량PCR기술검측Pim-3기인mRNA표체수평,운용단백면역인적기술검측Pim-3단백표체수평.결과:매절후획득7.5 kb적pGCSIL-GFP편단.DNA편단성공련접도pGCSIL-GFP재체；중조만병독적적도약위2×109 TU/mL.만병독능구고효감염파세포,병현저억제내원성Pim-3기인적mRNA(억제솔초과70％)화단백(억제솔초과80％)표체.결론:침대Pim-3기인파서렬CCTCTTCGACTTCATCACT적shRNA중조만병독능구유효침묵파세포Pim-3기인.