CAJ | 학술논문

RNA干扰(RNAi)是由小干扰RNA(siRNA)引发的生物细胞内同源基因的转录后基因沉默现象,是近年来兴起的一项研究生物基因调控与功能的崭新技术.庚型肝炎病毒(HGV)是一单正链RNA病毒,复制时不与宿主细胞基因组整合,尤其适合用于RNAi的研究.构建了含HGV完整结构基因并携带筛选标志潮霉素基因的真核表达载体pVAX.EH,转染Huh-7细胞后,筛选获得稳定表达HGV结构蛋白的Huh-7细胞株(Huh-7-EH).RT-PCR和Western blot检测证实,HGV结构基因能在Huh-7-EH细胞中转录、表达,并能进行剪切和翻译后修饰.以体外转录法制备了2对靶向HGV E2基因的siRNA(1-E2 siRNA和2-E2 siRNA),将其导入Huh-7-EH细胞中,采用Western blot和克隆形成实验证实,HGV 1-E2 siRNA和2-E2 siRNA均能特异性抑制HGV结构蛋白的表达,抑制作用可维持1周以上.其中2-E2 siRNA的抑制作用更强,转染后对Huh-7-EH细胞潮霉素抗性克隆形成的抑制率达到了99%.Huh-7-EH细胞转染siRNA后对潮霉素敏感,说明HGV E2 siRNA不仅使HGV E2区的mRNA降解,还可使融合在HGV E2区下游的潮霉素mRNA降解.综上所述,本实验建立的稳定表达HGV结构蛋白的Huh-7-EH细胞株,能作为用于研究HGV复制和RNAi的细胞模型;HGV结构基因区的siRNA可同时抑制HGV结构蛋白及其下游的潮霉素基因的表达,证明RNAi在真核细胞Huh-7-EH内可能存在放大作用.
RNA간우(RNAi)시유소간우RNA(siRNA)인발적생물세포내동원기인적전록후기인침묵현상,시근년래흥기적일항연구생물기인조공여공능적참신기술.경형간염병독(HGV)시일단정련RNA병독,복제시불여숙주세포기인조정합,우기괄합용우RNAi적연구.구건료함HGV완정결구기인병휴대사선표지조매소기인적진핵표체재체pVAX.EH,전염Huh-7세포후,사선획득은정표체HGV결구단백적Huh-7세포주(Huh-7-EH).RT-PCR화Western blot검측증실,HGV결구기인능재Huh-7-EH세포중전록、표체,병능진행전절화번역후수식.이체외전록법제비료2대파향HGV E2기인적siRNA(1-E2 siRNA화2-E2 siRNA),장기도입Huh-7-EH세포중,채용Western blot화극륭형성실험증실,HGV 1-E2 siRNA화2-E2 siRNA균능특이성억제HGV결구단백적표체,억제작용가유지1주이상.기중2-E2 siRNA적억제작용경강,전염후대Huh-7-EH세포조매소항성극륭형성적억제솔체도료99%.Huh-7-EH세포전염siRNA후대조매소민감,설명HGV E2 siRNA불부사HGV E2구적mRNA강해,환가사융합재HGV E2구하유적조매소mRNA강해.종상소술,본실험건립적은정표체HGV결구단백적Huh-7-EH세포주,능작위용우연구HGV복제화RNAi적세포모형;HGV결구기인구적siRNA가동시억제HGV결구단백급기하유적조매소기인적표체,증명RNAi재진핵세포Huh-7-EH내가능존재방대작용.