CAJ | 학술논문

目的: 利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1 病毒蛋白R(viral protein R,Vpr)基因的重组腺病毒,使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3,并在其中表达Vpr.方法: 自表达载体pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-Vpr,经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后,利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌.挑选同源重组质粒,经Pac Ⅰ酶切后回收大片段,并将其转染包装细胞AD293.利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达.收集第一代重组病毒上清,使之感染AD293细胞得到第二代病毒,如此反复感染AD293细胞3～4轮,使病毒大量扩增.梯度稀释法测定病毒滴度后,分别以感染复数(MOI)为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3,荧光显微镜观察细胞中GFP表达,并利用RT-PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况.结果: 经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒,滴度为3.0×108 efu/ml.以MOI为5的重组腺病毒感染24 h后,80%以上的靶细胞能够表达GFP,RT-PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达.结论: 成功构建含Vpr基因重组腺病毒,并且病毒能够有效感染PC-3细胞,使得目的基因在其中获得大量表达,为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础.
목적: 이용AdEasy선병독재체계통구건함HIV-1 병독단백R(viral protein R,Vpr)기인적중조선병독,사지유효감염파세포전렬선암세포계PC-3,병재기중표체Vpr.방법: 자표체재체pCI-neo-Vpr중확증출Vpr기인,삽입도pAdTrack-CMV중구건성선병독천사질립pAdTrack-Vpr,경한제성내절매Pme Ⅰ매절선성화후,이용린산개개도법장기여선병독골가질립pAdEasy공동전화도BJ5183대장애희균.도선동원중조질립,경Pac Ⅰ매절후회수대편단,병장기전염포장세포AD293.이용형광현미경관찰AD293세포중록색형광단백(GFP)표체.수집제일대중조병독상청,사지감염AD293세포득도제이대병독,여차반복감염AD293세포3～4륜,사병독대량확증.제도희석법측정병독적도후,분별이감염복수(MOI)위1、5、10적병독량감염파세포PC-3,형광현미경관찰세포중GFP표체,병이용RT-PCR화단백질인적기술분별종mRNA화단백수평검측목적기인적전록여표체정황.결과: 경한제성내절매검측、GFP표체화병독상청액PCR증실성공구건료휴대Vpr기인적중조선병독,적도위3.0×108 efu/ml.이MOI위5적중조선병독감염24 h후,80%이상적파세포능구표체GFP,RT-PCR화단백질인적능구동시검측도목적기인Vpr적전록여표체.결론: 성공구건함Vpr기인중조선병독,병차병독능구유효감염PC-3세포,사득목적기인재기중획득대량표체,위진일보연구Vpr단백대PC-3종류세포적영향급기가능섭급적신호통로전정료기출.