生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2002年
5期
588-592
,共5页
孙洁霖%张朝春%周丽%杨希才
孫潔霖%張朝春%週麗%楊希纔
손길림%장조춘%주려%양희재
多体自切割%核酶%苹果锈果类病毒%转录%体外切割活性
多體自切割%覈酶%蘋果鏽果類病毒%轉錄%體外切割活性
다체자절할%핵매%평과수과류병독%전록%체외절할활성
将苹果锈果类病毒的1个14nt的靶序列连接在锤头型核酶的3＇末端,构成自切割核酶.经人工合成和PCR扩增,克隆在转录载体pGEM7zf(+)的Xho Ⅰ-Hind Ⅲ位点.利用限制酶Xho I与Sal Ⅰ的连接,消失其识别位点序列,将自切割核酶片段插入到重组质粒中,经连续5次亚克隆,分别获得2、4、6、8、10和12拷贝的多体自切割核酶.在T7RNA聚合酶作用下,线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子,提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度.用相同摩尔浓度的单体和12体自切割核酶分别对32P标记的靶ASSVd进行反式切割,核酶与靶RNA摩尔浓度比为1:1.放射自显影结果表明:多体自切割核酶对靶ASSVd的切割效率明显高于单体自切割核酶.我们推测多体自切割核酶在体内系统中可能具有更好的应用价值.
將蘋果鏽果類病毒的1箇14nt的靶序列連接在錘頭型覈酶的3＇末耑,構成自切割覈酶.經人工閤成和PCR擴增,剋隆在轉錄載體pGEM7zf(+)的Xho Ⅰ-Hind Ⅲ位點.利用限製酶Xho I與Sal Ⅰ的連接,消失其識彆位點序列,將自切割覈酶片段插入到重組質粒中,經連續5次亞剋隆,分彆穫得2、4、6、8、10和12拷貝的多體自切割覈酶.在T7RNA聚閤酶作用下,線性化重組質粒轉錄的多體自切割覈酶通過內部的順式切割釋放齣較多數量的覈酶分子,提示在轉錄水平能夠提高覈酶轉錄物的濃度.用相同摩爾濃度的單體和12體自切割覈酶分彆對32P標記的靶ASSVd進行反式切割,覈酶與靶RNA摩爾濃度比為1:1.放射自顯影結果錶明:多體自切割覈酶對靶ASSVd的切割效率明顯高于單體自切割覈酶.我們推測多體自切割覈酶在體內繫統中可能具有更好的應用價值.
장평과수과류병독적1개14nt적파서렬련접재추두형핵매적3＇말단,구성자절할핵매.경인공합성화PCR확증,극륭재전록재체pGEM7zf(+)적Xho Ⅰ-Hind Ⅲ위점.이용한제매Xho I여Sal Ⅰ적련접,소실기식별위점서렬,장자절할핵매편단삽입도중조질립중,경련속5차아극륭,분별획득2、4、6、8、10화12고패적다체자절할핵매.재T7RNA취합매작용하,선성화중조질립전록적다체자절할핵매통과내부적순식절할석방출교다수량적핵매분자,제시재전록수평능구제고핵매전록물적농도.용상동마이농도적단체화12체자절할핵매분별대32P표기적파ASSVd진행반식절할,핵매여파RNA마이농도비위1:1.방사자현영결과표명:다체자절할핵매대파ASSVd적절할효솔명현고우단체자절할핵매.아문추측다체자절할핵매재체내계통중가능구유경호적응용개치.
