CAJ | 학술논문

目的构建含有金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的重组质粒并以其为模板建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测TIMP-1的标准曲线,为荧光定量PCR准确检测TIMP-1奠定基础.方法提取大鼠星状细胞系HSC-T6的mRNA,经RT-PCR扩增TIMP-1基因后与pGMT-Vector 连接,转化到大肠杆菌DH5α,以筛选得到的阳性克隆质粒作为标准品进行梯度稀释,分别用Taqman荧光探针技术和SYBR Green I荧光染料技术进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对两者结果进行了对比.同时进行普通PCR检测,与荧光定量PCR方法检测结果进行比较.结果重组质粒经PCR扩增及序列测定,表明pGMT-TIMP-1基因已成功克隆.以不同稀释水平的标准品质粒进行荧光定量PCR扩增, 应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线的线性检测范围为7×104～7×108拷贝,检测灵敏度为7×104拷贝;应用SYBR Green I荧光染料技术的线性检测范围为7×106～7×108拷贝,检测灵敏度为7×106拷贝,且熔解曲线显示出现非特异性扩增;两种技术相对于普通PCR技术均具有定量功能.结论所构建的pGMT-TIMP-1基因荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好, 灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为荧光定量PCR检测TIMP-1基因的标准方法.
목적구건함유금속단백매조직억제인자-1(TIMP-1)적중조질립병이기위모판건립형광정량취합매련반응(PCR)기술검측TIMP-1적표준곡선,위형광정량PCR준학검측TIMP-1전정기출.방법제취대서성상세포계HSC-T6적mRNA,경RT-PCR확증TIMP-1기인후여pGMT-Vector 련접,전화도대장간균DH5α,이사선득도적양성극륭질립작위표준품진행제도희석,분별용Taqman형광탐침기술화SYBR Green I형광염료기술진행형광정량PCR검측,건립표준곡선,병대량자결과진행료대비.동시진행보통PCR검측,여형광정량PCR방법검측결과진행비교.결과중조질립경PCR확증급서렬측정,표명pGMT-TIMP-1기인이성공극륭.이불동희석수평적표준품질립진행형광정량PCR확증, 응용Taqman형광탐침기술건립적표준곡선적선성검측범위위7×104～7×108고패,검측령민도위7×104고패;응용SYBR Green I형광염료기술적선성검측범위위7×106～7×108고패,검측령민도위7×106고패,차용해곡선현시출현비특이성확증;량충기술상대우보통PCR기술균구유정량공능.결론소구건적pGMT-TIMP-1기인형광정량PCR검측표준품응용Taqman형광탐침기술건립적표준곡선선성관계호, 령민도화특이성고,준학가고,차방법가작위형광정량PCR검측TIMP-1기인적표준방법.