华中科技大学学报(医学版)
華中科技大學學報(醫學版)
화중과기대학학보(의학판)
JOURNAL OF HUAZHONG UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(HEALTH SCIENCES)
2011年
1期
75-79
,共5页
DREAM基因%RNA干扰%重组腺相关病毒载体
DREAM基因%RNA榦擾%重組腺相關病毒載體
DREAM기인%RNA간우%중조선상관병독재체
目的 构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况.方法 设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平.结果 经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P＜0.05).结论 成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体.
目的 構建錶達DREAM基因的小分子榦擾RNA(siRNA)重組腺相關病毒(rAAV)載體,併觀察感染PC12細胞後DREAM蛋白錶達受抑製情況.方法 設計併閤成shRNA對應的2條互補的寡覈苷痠鏈,pDC316-EGFP-U6質粒經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切與退火後的寡覈苷痠連接,構建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6質粒,以其為模闆設計引物併引入EcoRⅠ和SalⅠ位點,PCR產物酶切後與pSANV2.0連接構建重組質粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切測序證實後,重組腺相關病毒介導將pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12細胞,Western blot檢測DREAM蛋白錶達水平.結果 經PCR、酶切及測序證實,重組腺相關病毒載體質粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP構建成功,包裝成病毒感染PC12細胞48 h後,Western blot結果顯示與對照組細胞相比,DREAM蛋白錶達水平顯著下降(P＜0.05).結論 成功構建和篩選齣介導特異性shRNA-DREAM的重組腺相關病毒載體.
목적 구건표체DREAM기인적소분자간우RNA(siRNA)중조선상관병독(rAAV)재체,병관찰감염PC12세포후DREAM단백표체수억제정황.방법 설계병합성shRNA대응적2조호보적과핵감산련,pDC316-EGFP-U6질립경BamHⅠ화HindⅢ쌍매절여퇴화후적과핵감산련접,구건pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6질립,이기위모판설계인물병인입EcoRⅠ화SalⅠ위점,PCR산물매절후여pSANV2.0련접구건중조질립pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,매절측서증실후,중조선상관병독개도장pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP감염PC12세포,Western blot검측DREAM단백표체수평.결과 경PCR、매절급측서증실,중조선상관병독재체질립pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP구건성공,포장성병독감염PC12세포48 h후,Western blot결과현시여대조조세포상비,DREAM단백표체수평현저하강(P＜0.05).결론 성공구건화사선출개도특이성shRNA-DREAM적중조선상관병독재체.
