江苏农业学报
江囌農業學報
강소농업학보
JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES
2012年
3期
586-592
,共7页
金贤华%林嘉鹏%白杰%刘晨曦%汪立芹%阿米娜%周川%黄俊成
金賢華%林嘉鵬%白傑%劉晨晞%汪立芹%阿米娜%週川%黃俊成
금현화%림가붕%백걸%류신희%왕립근%아미나%주천%황준성
BMPR-1B基因%shRNA%HEK293细胞%慢病毒
BMPR-1B基因%shRNA%HEK293細胞%慢病毒
BMPR-1B기인%shRNA%HEK293세포%만병독
为获得有效干扰绵羊BMPR-1B基因的shRNA干扰分子,从绵羊卵巢组织中扩增了l515bpBMPR-1B基因全长编码区cDNA序列,添加HA标签序列后,插入Plex-mcs慢病毒质粒,构建Plex-BMPR-1B慢病毒表达载体,转染HEK293细胞,并与2个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,用获得的重组慢病毒感染HEK293细胞;同时,将7个干扰分子与Pll-LentiLox3.7载体重组,并与3个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,获得干扰分子的重组病毒颗粒.最后用干扰分子重组的病毒颗粒感染整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞,进行qRTPCR和Western blot检测.结果显示:重组BMPR-1B蛋白质在稳定整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞系中获得了表达;研究中设计的7个shRNA分子能抑制绵羊BMPR-1B基因表达水平68.30%～99.86%,其中PLL-BMPR-1B-1306和PLL-BMPR-1B-1475干扰分子的干扰效果最好.
為穫得有效榦擾綿羊BMPR-1B基因的shRNA榦擾分子,從綿羊卵巢組織中擴增瞭l515bpBMPR-1B基因全長編碼區cDNA序列,添加HA標籤序列後,插入Plex-mcs慢病毒質粒,構建Plex-BMPR-1B慢病毒錶達載體,轉染HEK293細胞,併與2箇包裝質粒共轉染293T細胞進行病毒包裝,用穫得的重組慢病毒感染HEK293細胞;同時,將7箇榦擾分子與Pll-LentiLox3.7載體重組,併與3箇包裝質粒共轉染293T細胞進行病毒包裝,穫得榦擾分子的重組病毒顆粒.最後用榦擾分子重組的病毒顆粒感染整閤Plex-BMPR-1B的HEK293細胞,進行qRTPCR和Western blot檢測.結果顯示:重組BMPR-1B蛋白質在穩定整閤Plex-BMPR-1B的HEK293細胞繫中穫得瞭錶達;研究中設計的7箇shRNA分子能抑製綿羊BMPR-1B基因錶達水平68.30%～99.86%,其中PLL-BMPR-1B-1306和PLL-BMPR-1B-1475榦擾分子的榦擾效果最好.
위획득유효간우면양BMPR-1B기인적shRNA간우분자,종면양란소조직중확증료l515bpBMPR-1B기인전장편마구cDNA서렬,첨가HA표첨서렬후,삽입Plex-mcs만병독질립,구건Plex-BMPR-1B만병독표체재체,전염HEK293세포,병여2개포장질립공전염293T세포진행병독포장,용획득적중조만병독감염HEK293세포;동시,장7개간우분자여Pll-LentiLox3.7재체중조,병여3개포장질립공전염293T세포진행병독포장,획득간우분자적중조병독과립.최후용간우분자중조적병독과립감염정합Plex-BMPR-1B적HEK293세포,진행qRTPCR화Western blot검측.결과현시:중조BMPR-1B단백질재은정정합Plex-BMPR-1B적HEK293세포계중획득료표체;연구중설계적7개shRNA분자능억제면양BMPR-1B기인표체수평68.30%～99.86%,기중PLL-BMPR-1B-1306화PLL-BMPR-1B-1475간우분자적간우효과최호.
