CAJ | 학술논문

目的:观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人食管鳞癌细胞系Eca-109中HIF-1α基因的沉默效应,筛选有效干扰靶点.方法:设计合成干扰缺氧诱导因子-1αRNA寡核苷酸片段,经退火、连接等步骤克隆至线性化的PGCsi真核表达载体上,测序鉴定.应用LipofectamineTM 2000将该质粒分别转染Eca-109细胞和293T细胞,其中Eca-109抗性细胞又经2-4 wk的G418筛选.荧光显微镜评估转染效率,荧光定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA表达情况,Western blot检测HIF-1α蛋白表达情况.结果:成功构建了3个靶点的重组质粒pGCsiH1-shHIF, 293T细胞平均转染效率为约85.4%,Eca-109细胞的平均转染效率约73.2%.荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染这3种重组质粒的293T细胞和筛选2 wk的Eca-109细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达均较对照组有不同程度的下降,其中2号和3号靶点的干扰效应尤为明显.在瞬时转染72 h后的293T细胞中,其抑制率分别达到了78.5%、86.9%(P=0.000,P=0.000 vs 72 h空白对照组),筛选2 wk的Eca-109细胞中,3号靶点对HIF-1αmRNA的抑制率也达到了69.7%(P=0.000 vs2 wk空白对照组).结论:重组质粒pGCsi-shHIF能有效抑制食管鳞癌细胞Eca-109中HIF-1α基因的表达,经不同细胞中的瞬时和稳定转染筛选出了有效干扰靶位.
목적:관찰결양유도인자-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)단발협상RNA(short hairpin RNA,shRNA)대인식관린암세포계Eca-109중HIF-1α기인적침묵효응,사선유효간우파점.방법:설계합성간우결양유도인자-1αRNA과핵감산편단,경퇴화、련접등보취극륭지선성화적PGCsi진핵표체재체상,측서감정.응용LipofectamineTM 2000장해질립분별전염Eca-109세포화293T세포,기중Eca-109항성세포우경2-4 wk적G418사선.형광현미경평고전염효솔,형광정량RT-PCR검측HIF-1αmRNA표체정황,Western blot검측HIF-1α단백표체정황.결과:성공구건료3개파점적중조질립pGCsiH1-shHIF, 293T세포평균전염효솔위약85.4%,Eca-109세포적평균전염효솔약73.2%.형광정량RT-PCR화Western blot현시순시전염저3충중조질립적293T세포화사선2 wk적Eca-109세포HIF-1αmRNA화단백표체균교대조조유불동정도적하강,기중2호화3호파점적간우효응우위명현.재순시전염72 h후적293T세포중,기억제솔분별체도료78.5%、86.9%(P=0.000,P=0.000 vs 72 h공백대조조),사선2 wk적Eca-109세포중,3호파점대HIF-1αmRNA적억제솔야체도료69.7%(P=0.000 vs2 wk공백대조조).결론:중조질립pGCsi-shHIF능유효억제식관린암세포Eca-109중HIF-1α기인적표체,경불동세포중적순시화은정전염사선출료유효간우파위.