畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2008年
5期
547-554
,共8页
郑喜邦%云彦%胡勇策%李勇%王华岩%窦忠英
鄭喜邦%雲彥%鬍勇策%李勇%王華巖%竇忠英
정희방%운언%호용책%리용%왕화암%두충영
牛%Nanog%分子克隆%真核表达
牛%Nanog%分子剋隆%真覈錶達
우%Nanog%분자극륭%진핵표체
本研究克隆了牛Nanog基因,构建其真核表达载体,并转染皮肤成纤维细胞,获得能够用作核移植供核细胞的稳定转染细胞株.从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增Nanog基因,将其克隆到pMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pCDNA3-FLAG表达载体上,挑选序列正确的真核表达质粒pCDNA3-Nanog转染牛皮肤成纤维细胞,获得了稳定转染的细胞株.用RT-PCR和Western Blotting分别检测Nanog mRNA和FLAG-Nanog融合蛋白的表达,用免疫染色法验证该细胞株是否具有干细胞特征.结果表明:(1)从胎牛原始生殖嵴中克隆了序列正确的Nanog全长编码序列;(2)所构建的pFLAG-Nanog重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中高效表达;(3)所获稳定转染的细胞株能表达ES细胞表面抗原SSEA-4和多能性维持因子Nanog、 Oct-4,表明其具有一定的多能性.为进一步研究Nanog基因功能,尤其是探讨它在家畜早期胚胎发育、生产转基因动物,以及胚胎干细胞建系中的作用奠定了基础.
本研究剋隆瞭牛Nanog基因,構建其真覈錶達載體,併轉染皮膚成纖維細胞,穫得能夠用作覈移植供覈細胞的穩定轉染細胞株.從6週齡的胎牛原始生殖嵴中提取總RNA,通過RT-PCR擴增Nanog基因,將其剋隆到pMD-18T載體,再從酶切鑒定和測序正確的質粒上切下目的片段,定嚮剋隆到pCDNA3-FLAG錶達載體上,挑選序列正確的真覈錶達質粒pCDNA3-Nanog轉染牛皮膚成纖維細胞,穫得瞭穩定轉染的細胞株.用RT-PCR和Western Blotting分彆檢測Nanog mRNA和FLAG-Nanog融閤蛋白的錶達,用免疫染色法驗證該細胞株是否具有榦細胞特徵.結果錶明:(1)從胎牛原始生殖嵴中剋隆瞭序列正確的Nanog全長編碼序列;(2)所構建的pFLAG-Nanog重組質粒能夠在皮膚成纖維細胞中高效錶達;(3)所穫穩定轉染的細胞株能錶達ES細胞錶麵抗原SSEA-4和多能性維持因子Nanog、 Oct-4,錶明其具有一定的多能性.為進一步研究Nanog基因功能,尤其是探討它在傢畜早期胚胎髮育、生產轉基因動物,以及胚胎榦細胞建繫中的作用奠定瞭基礎.
본연구극륭료우Nanog기인,구건기진핵표체재체,병전염피부성섬유세포,획득능구용작핵이식공핵세포적은정전염세포주.종6주령적태우원시생식척중제취총RNA,통과RT-PCR확증Nanog기인,장기극륭도pMD-18T재체,재종매절감정화측서정학적질립상절하목적편단,정향극륭도pCDNA3-FLAG표체재체상,도선서렬정학적진핵표체질립pCDNA3-Nanog전염우피부성섬유세포,획득료은정전염적세포주.용RT-PCR화Western Blotting분별검측Nanog mRNA화FLAG-Nanog융합단백적표체,용면역염색법험증해세포주시부구유간세포특정.결과표명:(1)종태우원시생식척중극륭료서렬정학적Nanog전장편마서렬;(2)소구건적pFLAG-Nanog중조질립능구재피부성섬유세포중고효표체;(3)소획은정전염적세포주능표체ES세포표면항원SSEA-4화다능성유지인자Nanog、 Oct-4,표명기구유일정적다능성.위진일보연구Nanog기인공능,우기시탐토타재가축조기배태발육、생산전기인동물,이급배태간세포건계중적작용전정료기출.
