中国临床康复
中國臨床康複
중국림상강복
CHINESE JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATION
2005年
26期
51-53
,共3页
蔡善保%杨民%马庆军%余希杰%党耕町%王申五%马大龙
蔡善保%楊民%馬慶軍%餘希傑%黨耕町%王申五%馬大龍
채선보%양민%마경군%여희걸%당경정%왕신오%마대룡
组织工程%骨形态发生蛋白质类%基因%反转录病毒%骨髓细胞
組織工程%骨形態髮生蛋白質類%基因%反轉錄病毒%骨髓細胞
조직공정%골형태발생단백질류%기인%반전록병독%골수세포
目的:构建人骨形态发生蛋白2反转录病毒表达载体,探讨以转人骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞为种子细胞的组织工程骨修复骨缺损的可行性.方法:实验于2001-05/2003-01在北京大学医学部完成.①采用DNA重组技术,将骨形态发生蛋白2cDNA克隆到pLXSN反转录病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/BMP2重组反转录病毒.取15 d龄BALB/c系小鼠5只用于骨髓基质细胞的提取.将重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞,经筛选后,聚合酶链反应鉴定人骨形态发生蛋白2cDNA在转基因骨髓基质细胞中的整合情况.②转基因骨髓基质细胞的骨形态发生蛋白2表达情况采用免疫印渍杂交和核糖核酸印渍杂交技术检测.转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶的表达采用钙-钴法染色检测,用以评定表达骨形态发生蛋白2的生物活性.③取6周龄BALB/c小鼠6只,将转基因骨髓基质细胞与羟基磷灰石构建人工骨植于小鼠骨骼肌内,体内成骨情况予组织学观察评估.结果:①pLXSN/BMP2质粒的鉴定结果:经酶切及DNA测序证实重组pLXSN/BMP2序列正确.②重组病毒的滴度测定结果:包装的病毒滴度为(6～8)×105cfu/mL.③基因整合及表达的分析:聚合酶链反应证实转基因骨髓基质细胞基因组中有骨形态发生蛋白2 cDNA整合;核糖核酸印渍杂交和蛋白免疫印渍杂交证实转基因骨髓基质细胞稳定表达人骨形态发生蛋白2;钙-钴法染色证实转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶阳性.④小鼠体内成骨情况:甲苯胺蓝染色的组织切片镜下观察显示转骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞构成人工骨可见少量软骨细胞及软骨基质存在,软骨细胞呈巢状分布.结论:成功地构建了pLXSN-BMP2重组反转录病毒载体,该载体不仅有效地表达骨形态发生蛋白2蛋白,表达的骨形态发生蛋白2能够诱导未分化的骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,且在体内肌肉环境下能促进成骨.
目的:構建人骨形態髮生蛋白2反轉錄病毒錶達載體,探討以轉人骨形態髮生蛋白2基因骨髓基質細胞為種子細胞的組織工程骨脩複骨缺損的可行性.方法:實驗于2001-05/2003-01在北京大學醫學部完成.①採用DNA重組技術,將骨形態髮生蛋白2cDNA剋隆到pLXSN反轉錄病毒質粒,經酶切及測序鑒定正確後,包裝成為pLXSN/BMP2重組反轉錄病毒.取15 d齡BALB/c繫小鼠5隻用于骨髓基質細胞的提取.將重組病毒感染小鼠骨髓基質細胞,經篩選後,聚閤酶鏈反應鑒定人骨形態髮生蛋白2cDNA在轉基因骨髓基質細胞中的整閤情況.②轉基因骨髓基質細胞的骨形態髮生蛋白2錶達情況採用免疫印漬雜交和覈糖覈痠印漬雜交技術檢測.轉基因骨髓基質細胞堿性燐痠酶的錶達採用鈣-鈷法染色檢測,用以評定錶達骨形態髮生蛋白2的生物活性.③取6週齡BALB/c小鼠6隻,將轉基因骨髓基質細胞與羥基燐灰石構建人工骨植于小鼠骨骼肌內,體內成骨情況予組織學觀察評估.結果:①pLXSN/BMP2質粒的鑒定結果:經酶切及DNA測序證實重組pLXSN/BMP2序列正確.②重組病毒的滴度測定結果:包裝的病毒滴度為(6～8)×105cfu/mL.③基因整閤及錶達的分析:聚閤酶鏈反應證實轉基因骨髓基質細胞基因組中有骨形態髮生蛋白2 cDNA整閤;覈糖覈痠印漬雜交和蛋白免疫印漬雜交證實轉基因骨髓基質細胞穩定錶達人骨形態髮生蛋白2;鈣-鈷法染色證實轉基因骨髓基質細胞堿性燐痠酶暘性.④小鼠體內成骨情況:甲苯胺藍染色的組織切片鏡下觀察顯示轉骨形態髮生蛋白2基因骨髓基質細胞構成人工骨可見少量軟骨細胞及軟骨基質存在,軟骨細胞呈巢狀分佈.結論:成功地構建瞭pLXSN-BMP2重組反轉錄病毒載體,該載體不僅有效地錶達骨形態髮生蛋白2蛋白,錶達的骨形態髮生蛋白2能夠誘導未分化的骨髓基質細胞嚮成骨細胞方嚮分化,且在體內肌肉環境下能促進成骨.
목적:구건인골형태발생단백2반전록병독표체재체,탐토이전인골형태발생단백2기인골수기질세포위충자세포적조직공정골수복골결손적가행성.방법:실험우2001-05/2003-01재북경대학의학부완성.①채용DNA중조기술,장골형태발생단백2cDNA극륭도pLXSN반전록병독질립,경매절급측서감정정학후,포장성위pLXSN/BMP2중조반전록병독.취15 d령BALB/c계소서5지용우골수기질세포적제취.장중조병독감염소서골수기질세포,경사선후,취합매련반응감정인골형태발생단백2cDNA재전기인골수기질세포중적정합정황.②전기인골수기질세포적골형태발생단백2표체정황채용면역인지잡교화핵당핵산인지잡교기술검측.전기인골수기질세포감성린산매적표체채용개-고법염색검측,용이평정표체골형태발생단백2적생물활성.③취6주령BALB/c소서6지,장전기인골수기질세포여간기린회석구건인공골식우소서골격기내,체내성골정황여조직학관찰평고.결과:①pLXSN/BMP2질립적감정결과:경매절급DNA측서증실중조pLXSN/BMP2서렬정학.②중조병독적적도측정결과:포장적병독적도위(6～8)×105cfu/mL.③기인정합급표체적분석:취합매련반응증실전기인골수기질세포기인조중유골형태발생단백2 cDNA정합;핵당핵산인지잡교화단백면역인지잡교증실전기인골수기질세포은정표체인골형태발생단백2;개-고법염색증실전기인골수기질세포감성린산매양성.④소서체내성골정황:갑분알람염색적조직절편경하관찰현시전골형태발생단백2기인골수기질세포구성인공골가견소량연골세포급연골기질존재,연골세포정소상분포.결론:성공지구건료pLXSN-BMP2중조반전록병독재체,해재체불부유효지표체골형태발생단백2단백,표체적골형태발생단백2능구유도미분화적골수기질세포향성골세포방향분화,차재체내기육배경하능촉진성골.
