CAJ | 학술논문

目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,M)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础.方法为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化.毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)的竞争性配体甘露聚糖(mannan)的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞.结果毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量(Mr)为(66～97)×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致.该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生.结论毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞.
목적 이용필적효모표체단백구유고감로당수식적특성,재필적효모중표체감로당화수식적인용균매(human lysozyme,hLYZ);진이이용거서세포(macrophage,M)표면적감로당수체(mannose receptor,MR)장감로당화적인용균매내탄입포,위연구가입거서세포살멸기포내감염균적인용균매제공기출.방법 위사인용균매가이재효모중산생N-감로당화수식,재인용균매적C단설계2개N-당기화위점;통과재기C단융합증강형록색형광단백(enhanced green fluorescent protein,eGFP),관찰인용균매재거서세포RAW264.7중적아세포정위;동시재기C단인입료His표첨편우융합단백적순화.필적효모표체적hLYZ/eGFP여RAW264.7공부육,차조격광공취초현미경관찰해융합단백능부진입RAW264.7;통과거서세포감로당수체(macrophage mannose receptor,MMR)적경쟁성배체감로취당(mannan)적조단실험,검측감로당화적인용균매시부통과MMR개도내탄.결과 필적효모표체적hLYZ/eGFP융합단백시상대분자질량(Mr)위(66～97)×103적미산조대,태N-당감매F(PNGaseF)매절후,해융합단백변위Mr균일적조대,여비당기화hLYZ/eGFP융합단백적이론Mr일치.해융합단백여RAW264.7공부육후,가견세포질중존재eGFP적록색형광,이가입감로취당가이억제저일현상발생.결론 필적효모표체적hLYZ/eGFP융합단백위고감로당형당기수식단백,해단백가이통과MMR개도내탄진입거서세포.