中国医药生物技术
中國醫藥生物技術
중국의약생물기술
CHINESE MEDICINAL BIOTECHNOLOGY
2012年
2期
93-99
,共7页
史彦薇%王志芳%王伟%安建梅%孔建强
史彥薇%王誌芳%王偉%安建梅%孔建彊
사언미%왕지방%왕위%안건매%공건강
发光蛋白质类%酵母菌,酿酒%基因表达
髮光蛋白質類%酵母菌,釀酒%基因錶達
발광단백질류%효모균,양주%기인표체
目的 研究红色荧光蛋白编码基因 Dsred 在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达.方法 根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠 PCR方法 快速克隆获得全长 Dsred 基因,将其与 pMD-18T 载体连接后进行测序鉴定.通过 In-fusion 方法 将鉴定正确的pMD-Dsred 重组载体与酿酒酵母表达载体 pYeDP60 进行连接,测序后利用 LiAc 方法 将鉴定正确的 pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌 W303-1B 中,PCR 扩增筛选阳性克隆,获得的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌经诱导培养后进行 SDS-PAGE 电泳分析和绿光激发荧光成像检测.将工程菌分别接种至 YPD、YPG、SCG 和 SCD 培养基,培养 48、72、96、120 和 144 h 后分别测定吸光度(A600)值.取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于 -70、-20、4、28 和 37 ℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性.结果 连续重叠 PCR 扩增和测序鉴定结果 表明,扩增获得的 Dsred 基因长为 678 bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred 基因已成功插入 pYeDP60-Dsred 重组表达载体,且受酵母诱导型启动子 GAL10-CYC1 调控表达.PCR扩增筛选和 SDS-PAGE 分析显示,pYeDP60-Dsred 重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光.4 种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred 红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长.荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在 37 ℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快.结论 成功构建了 pYeDP60-Dsred 重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred 基因在酿酒酵母菌体内的异源表达.红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟.
目的 研究紅色熒光蛋白編碼基因 Dsred 在釀酒酵母菌中的快速剋隆與錶達.方法 根據已髮錶基因序列設計引物,採用連續重疊 PCR方法 快速剋隆穫得全長 Dsred 基因,將其與 pMD-18T 載體連接後進行測序鑒定.通過 In-fusion 方法 將鑒定正確的pMD-Dsred 重組載體與釀酒酵母錶達載體 pYeDP60 進行連接,測序後利用 LiAc 方法 將鑒定正確的 pYeDP60-Dsred重組錶達載體轉化至釀酒酵母菌 W303-1B 中,PCR 擴增篩選暘性剋隆,穫得的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌經誘導培養後進行 SDS-PAGE 電泳分析和綠光激髮熒光成像檢測.將工程菌分彆接種至 YPD、YPG、SCG 和 SCD 培養基,培養 48、72、96、120 和 144 h 後分彆測定吸光度(A600)值.取誘導錶達後的工程菌(菌液組)進行離心(菌體組)、離心後加甘油(高滲組)處理,分彆置于 -70、-20、4、28 和 37 ℃條件培養,熒光顯微鏡觀察其錶達特性.結果 連續重疊 PCR 擴增和測序鑒定結果 錶明,擴增穫得的 Dsred 基因長為 678 bp,其序列與已髮錶的基因序列完全一緻;Dsred 基因已成功插入 pYeDP60-Dsred 重組錶達載體,且受酵母誘導型啟動子 GAL10-CYC1 調控錶達.PCR擴增篩選和 SDS-PAGE 分析顯示,pYeDP60-Dsred 重組錶達載體已成功導入釀酒酵母菌中,誘導錶達產物相對分子質量與預期相符,且誘導後工程菌可在綠光激髮下髮齣紅色熒光.4 種培養基內工程菌的菌體生長情況無明顯差彆,重組Dsred 紅色熒光蛋白錶達不會抑製釀酒酵母菌體生長.熒光顯微鏡觀察顯示,工程菌經不同處理後,高滲組紅色熒光蛋白成熟時間最短,菌液組時間最長;紅色熒光蛋白在 37 ℃條件下培養時成熟最早,但降解速度較快.結論 成功構建瞭 pYeDP60-Dsred 重組釀酒酵母錶達載體,實現瞭Dsred 基因在釀酒酵母菌體內的異源錶達.紅色熒光蛋白錶達對釀酒酵母菌體生長無明顯影響,且離心保留菌體和加入甘油等缺水高滲處理都有利于紅色熒光蛋白的成熟.
목적 연구홍색형광단백편마기인 Dsred 재양주효모균중적쾌속극륭여표체.방법 근거이발표기인서렬설계인물,채용련속중첩 PCR방법 쾌속극륭획득전장 Dsred 기인,장기여 pMD-18T 재체련접후진행측서감정.통과 In-fusion 방법 장감정정학적pMD-Dsred 중조재체여양주효모표체재체 pYeDP60 진행련접,측서후이용 LiAc 방법 장감정정학적 pYeDP60-Dsred중조표체재체전화지양주효모균 W303-1B 중,PCR 확증사선양성극륭,획득적 W303B[pYeDP60-Dsred] 공정균경유도배양후진행 SDS-PAGE 전영분석화록광격발형광성상검측.장공정균분별접충지 YPD、YPG、SCG 화 SCD 배양기,배양 48、72、96、120 화 144 h 후분별측정흡광도(A600)치.취유도표체후적공정균(균액조)진행리심(균체조)、리심후가감유(고삼조)처리,분별치우 -70、-20、4、28 화 37 ℃조건배양,형광현미경관찰기표체특성.결과 련속중첩 PCR 확증화측서감정결과 표명,확증획득적 Dsred 기인장위 678 bp,기서렬여이발표적기인서렬완전일치;Dsred 기인이성공삽입 pYeDP60-Dsred 중조표체재체,차수효모유도형계동자 GAL10-CYC1 조공표체.PCR확증사선화 SDS-PAGE 분석현시,pYeDP60-Dsred 중조표체재체이성공도입양주효모균중,유도표체산물상대분자질량여예기상부,차유도후공정균가재록광격발하발출홍색형광.4 충배양기내공정균적균체생장정황무명현차별,중조Dsred 홍색형광단백표체불회억제양주효모균체생장.형광현미경관찰현시,공정균경불동처리후,고삼조홍색형광단백성숙시간최단,균액조시간최장;홍색형광단백재 37 ℃조건하배양시성숙최조,단강해속도교쾌.결론 성공구건료 pYeDP60-Dsred 중조양주효모표체재체,실현료Dsred 기인재양주효모균체내적이원표체.홍색형광단백표체대양주효모균체생장무명현영향,차리심보류균체화가입감유등결수고삼처리도유리우홍색형광단백적성숙.
