中华微生物学和免疫学杂志
中華微生物學和免疫學雜誌
중화미생물학화면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY
2007年
6期
525-531
,共7页
葡萄球菌肠毒素A%sea基因/定位突变%原核表达系统/构建%重组蛋白/细胞毒性%脾细胞/增殖%肿瘤细胞/抑制
葡萄毬菌腸毒素A%sea基因/定位突變%原覈錶達繫統/構建%重組蛋白/細胞毒性%脾細胞/增殖%腫瘤細胞/抑製
포도구균장독소A%sea기인/정위돌변%원핵표체계통/구건%중조단백/세포독성%비세포/증식%종류세포/억제
目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因及其突变体原核表达系统,了解突变前后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化.方法 采用高保真PCR和T-A克隆法,从金黄葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增并克隆了不含信号肽序列的sea基因.采用突变引物PCR构建sea基因定位突变体.建立sea基因及其定位突变体原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白.采用TCID50法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性.采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用.结果 所克隆的sea基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100%,7种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变.rSEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的52%.rSEA对Vero细胞TCID50为4.1μg,其突变体重组蛋白分别为5.8～23.5μg.1和5μg/ml的rSEA及其5种突变体重组蛋白rSEA/H187A、rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用(P＜0.05),10和20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml PHA相似(P＞0.05).5～20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60细胞生长(P＜0.05).结论 本研究成功地构建了sea基因突变体及其高效原核表达系统,其表达产物的细胞毒性均有所降低.由于rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H225A/D227A细胞毒性较低、促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物的候选突变体.
目的 構建葡萄毬菌腸毒素A(SEA)基因及其突變體原覈錶達繫統,瞭解突變前後重組錶達產物的細胞毒性、促淋巴細胞增殖和抑製腫瘤生長活性的變化.方法 採用高保真PCR和T-A剋隆法,從金黃葡萄毬菌ATCC13565株DNA中擴增併剋隆瞭不含信號肽序列的sea基因.採用突變引物PCR構建sea基因定位突變體.建立sea基因及其定位突變體原覈錶達繫統.Ni-NTA親和層析法提純錶達的目的重組蛋白.採用TCID50法測定目的重組蛋白對Vero細胞的細胞毒性.採用MTT比色法分彆檢測不同濃度的目的重組蛋白促小鼠脾細胞增殖及對抑製KB和HL-60癌細胞株生長的作用.結果 所剋隆的sea基因覈苷痠序列與報道序列的相似性為100%,7種突變體均在既定位置穫得預期的密碼子突變.rSEA和各突變體重組蛋白錶達量約為細菌總蛋白的52%.rSEA對Vero細胞TCID50為4.1μg,其突變體重組蛋白分彆為5.8～23.5μg.1和5μg/ml的rSEA及其5種突變體重組蛋白rSEA/H187A、rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A對小鼠脾細胞均有明顯的促增殖作用(P＜0.05),10和20μg/ml的rSEA及上述5種突變體重組蛋白促小鼠脾細胞增殖活性與100μg/ml PHA相似(P＞0.05).5～20μg/ml的rSEA及上述5種突變體重組蛋白作用的小鼠脾細胞上清及其上清與脾細胞混閤物均能有效地抑製KB和HL-60細胞生長(P＜0.05).結論 本研究成功地構建瞭sea基因突變體及其高效原覈錶達繫統,其錶達產物的細胞毒性均有所降低.由于rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H225A/D227A細胞毒性較低、促脾細胞增殖和抑製腫瘤細胞生長活性較彊,可作為研製升白細胞、抗腫瘤SEA相關藥物的候選突變體.
목적 구건포도구균장독소A(SEA)기인급기돌변체원핵표체계통,료해돌변전후중조표체산물적세포독성、촉림파세포증식화억제종류생장활성적변화.방법 채용고보진PCR화T-A극륭법,종금황포도구균ATCC13565주DNA중확증병극륭료불함신호태서렬적sea기인.채용돌변인물PCR구건sea기인정위돌변체.건립sea기인급기정위돌변체원핵표체계통.Ni-NTA친화층석법제순표체적목적중조단백.채용TCID50법측정목적중조단백대Vero세포적세포독성.채용MTT비색법분별검측불동농도적목적중조단백촉소서비세포증식급대억제KB화HL-60암세포주생장적작용.결과 소극륭적sea기인핵감산서렬여보도서렬적상사성위100%,7충돌변체균재기정위치획득예기적밀마자돌변.rSEA화각돌변체중조단백표체량약위세균총단백적52%.rSEA대Vero세포TCID50위4.1μg,기돌변체중조단백분별위5.8～23.5μg.1화5μg/ml적rSEA급기5충돌변체중조단백rSEA/H187A、rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A화rSEA/H225A/D227A대소서비세포균유명현적촉증식작용(P＜0.05),10화20μg/ml적rSEA급상술5충돌변체중조단백촉소서비세포증식활성여100μg/ml PHA상사(P＞0.05).5～20μg/ml적rSEA급상술5충돌변체중조단백작용적소서비세포상청급기상청여비세포혼합물균능유효지억제KB화HL-60세포생장(P＜0.05).결론 본연구성공지구건료sea기인돌변체급기고효원핵표체계통,기표체산물적세포독성균유소강저.유우rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H225A/D227A세포독성교저、촉비세포증식화억제종류세포생장활성교강,가작위연제승백세포、항종류SEA상관약물적후선돌변체.
