山东大学学报（医学版）
山東大學學報（醫學版）
산동대학학보（의학판）
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)
2006年
7期
649-653,661
,共6页
高新谱%刘正敏%王来城%焦玉莲%刘义庆%张雪%赵跃然
高新譜%劉正敏%王來城%焦玉蓮%劉義慶%張雪%趙躍然
고신보%류정민%왕래성%초옥련%류의경%장설%조약연
NKp46%基因克隆%原核表达%大肠杆菌%蛋白纯化
NKp46%基因剋隆%原覈錶達%大腸桿菌%蛋白純化
NKp46%기인극륭%원핵표체%대장간균%단백순화
目的:对人NKp46进行基因克隆并探讨其在大肠杆菌中重组表达和纯化.方法:用RT-PCR法自人外周血单个核细胞总RNA扩增hNKp46片段(约900 bp),克隆至质粒载体pMD18-T,并对克隆的DNA片段进行序列分析.用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18-T-hNKp46重组质粒,分离hNKp46片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pET30a(+)-hNKp46.转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组蛋白.采用His·Bind Purification Kit对重组蛋白进行纯化.结果:RT-PCR扩增的DNA片段与hNKp46 cDNA大小一致.重组质粒pMD18-T-hNKp46的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp46的cDNA序列一致.SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为38.5 kD,其表达量达菌体总蛋白的40%左右.Western Blotting分析显示,重组蛋白能特异地与抗His·Tag抗体结合.纯化得到纯度为95.5%的重组蛋白,纯化回收率达40%.结论:成功构建了人NKp46表达载体,并获得了稳定表达的工程菌株,纯化了重组蛋白.
目的:對人NKp46進行基因剋隆併探討其在大腸桿菌中重組錶達和純化.方法:用RT-PCR法自人外週血單箇覈細胞總RNA擴增hNKp46片段(約900 bp),剋隆至質粒載體pMD18-T,併對剋隆的DNA片段進行序列分析.用限製酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18-T-hNKp46重組質粒,分離hNKp46片段,併插入原覈錶達載體pET30a(+)的相應限製酶位點,酶譜分析鑒定重組錶達載體pET30a(+)-hNKp46.轉化菌株BL21(DE3)經IPTG誘導,用SDS-PAGE和Western Blotting鑒定錶達的重組蛋白.採用His·Bind Purification Kit對重組蛋白進行純化.結果:RT-PCR擴增的DNA片段與hNKp46 cDNA大小一緻.重組質粒pMD18-T-hNKp46的DNA序列分析顯示,剋隆的DNA序列與文獻報道的hNKp46的cDNA序列一緻.SDS-PAGE錶明,重組蛋白相對分子質量為38.5 kD,其錶達量達菌體總蛋白的40%左右.Western Blotting分析顯示,重組蛋白能特異地與抗His·Tag抗體結閤.純化得到純度為95.5%的重組蛋白,純化迴收率達40%.結論:成功構建瞭人NKp46錶達載體,併穫得瞭穩定錶達的工程菌株,純化瞭重組蛋白.
목적:대인NKp46진행기인극륭병탐토기재대장간균중중조표체화순화.방법:용RT-PCR법자인외주혈단개핵세포총RNA확증hNKp46편단(약900 bp),극륭지질립재체pMD18-T,병대극륭적DNA편단진행서렬분석.용한제매EcoRⅠ화NcoⅠ소화pMD18-T-hNKp46중조질립,분리hNKp46편단,병삽입원핵표체재체pET30a(+)적상응한제매위점,매보분석감정중조표체재체pET30a(+)-hNKp46.전화균주BL21(DE3)경IPTG유도,용SDS-PAGE화Western Blotting감정표체적중조단백.채용His·Bind Purification Kit대중조단백진행순화.결과:RT-PCR확증적DNA편단여hNKp46 cDNA대소일치.중조질립pMD18-T-hNKp46적DNA서렬분석현시,극륭적DNA서렬여문헌보도적hNKp46적cDNA서렬일치.SDS-PAGE표명,중조단백상대분자질량위38.5 kD,기표체량체균체총단백적40%좌우.Western Blotting분석현시,중조단백능특이지여항His·Tag항체결합.순화득도순도위95.5%적중조단백,순화회수솔체40%.결론:성공구건료인NKp46표체재체,병획득료은정표체적공정균주,순화료중조단백.
