CAJ | 학술논문

目的:细胞周期蛋白是细胞周期调控的决定性因子,RNA干涉是一种高效特异的基因沉默技术,能诱使细胞表现出特定基因缺失表型.通过RNA干扰阻断细胞周期蛋白D1基因表达,观察瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞周期的影响.方法:实验于2006-07/2007-05在南方医科大学基因工程研究所(BSL-2级)完成.①实验材料:小干扰性RNA设计采用软件是ambion公司的在线软件siRNA target finder,合成采用化学合成法,委托上海吉凯基因有限公司合成,再经过变性退火处理后得到双链小干扰性RNA;瘢痕疙瘩成纤维细胞标本取自南方医院整形外科瘢痕疙瘩患者(均获得患者或其家属同意).②实验过程及分组:将瘢痕疙瘩成纤维细胞应用脂质体法将针对细胞周期蛋白D1基因的小干扰RNA分子转染为实验组,细胞用等量脂质体处理为脂质体组,未处理组作为对照.③实验评估:于转染后24,48,72 h,光学显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术分析细胞周期;MTT法检测成纤维细胞的活性并绘制细胞生长曲线.结果:①转染特异性小干扰RNA后,细胞形态发生了异常改变,细胞由正常的长梭形变为圆形或椭圆形,提示可能是凋亡或坏死细胞.②转染后细胞周期G1期延长,S期缩短.转染特异性小干扰RNA 24,48,72 h后G1期细胞高于未处理组(依次为60.13%,66.22%,67.53%,54.53%);S期细胞低于未处理组(依次为18.25%,17.11%,11.15%,22.31%),表明细胞阻滞在G1期,进入S期细胞减少.③小干扰RNA-细胞周期蛋白D1转染后MTT法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞增值明显受到抑制,细胞生长曲线图表明,转染特异性小干扰RNA组细胞生长明显减缓.结论:特异性小干扰RNA分子能够抑制细胞周期蛋白D1基因的表达,使细胞阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡.
목적:세포주기단백시세포주기조공적결정성인자,RNA간섭시일충고효특이적기인침묵기술,능유사세포표현출특정기인결실표형.통과RNA간우조단세포주기단백D1기인표체,관찰반흔흘탑성섬유세포증식화세포주기적영향.방법:실험우2006-07/2007-05재남방의과대학기인공정연구소(BSL-2급)완성.①실험재료:소간우성RNA설계채용연건시ambion공사적재선연건siRNA target finder,합성채용화학합성법,위탁상해길개기인유한공사합성,재경과변성퇴화처리후득도쌍련소간우성RNA;반흔흘탑성섬유세포표본취자남방의원정형외과반흔흘탑환자(균획득환자혹기가속동의).②실험과정급분조:장반흔흘탑성섬유세포응용지질체법장침대세포주기단백D1기인적소간우RNA분자전염위실험조,세포용등량지질체처리위지질체조,미처리조작위대조.③실험평고:우전염후24,48,72 h,광학현미경관찰세포형태변화;류식세포술분석세포주기;MTT법검측성섬유세포적활성병회제세포생장곡선.결과:①전염특이성소간우RNA후,세포형태발생료이상개변,세포유정상적장사형변위원형혹타원형,제시가능시조망혹배사세포.②전염후세포주기G1기연장,S기축단.전염특이성소간우RNA 24,48,72 h후G1기세포고우미처리조(의차위60.13%,66.22%,67.53%,54.53%);S기세포저우미처리조(의차위18.25%,17.11%,11.15%,22.31%),표명세포조체재G1기,진입S기세포감소.③소간우RNA-세포주기단백D1전염후MTT법검측반흔흘탑성섬유세포증치명현수도억제,세포생장곡선도표명,전염특이성소간우RNA조세포생장명현감완.결론:특이성소간우RNA분자능구억제세포주기단백D1기인적표체,사세포조체우G1기,병유도세포조망.