生物医学工程学杂志
生物醫學工程學雜誌
생물의학공정학잡지
2003年
2期
255-259,280
,共6页
蔡绍晖%杜军%陈新年%黄宁%长濑文彦%长谷川高明%王伯瑶
蔡紹暉%杜軍%陳新年%黃寧%長瀨文彥%長穀川高明%王伯瑤
채소휘%두군%진신년%황저%장뢰문언%장곡천고명%왕백요
人β-防御素-2 COS-7细胞 基因重组 基因转染
人β-防禦素-2 COS-7細胞 基因重組 基因轉染
인β-방어소-2 COS-7세포 기인중조 기인전염
本研究旨在探索建立能有效表达和分泌人类β-防御素-2 (hBD-2),其表达产物又易于被检测和分离纯化的哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线.将hBD-2的全长cDNA片段插入编码双重报告基因Myc和6 个多聚组氨酸(His)的真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(+),构建出C端带Myc和6×His的rpcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2.用脂质体转染法将此重组真核表达载体导入COS-7细胞,分别从mRNA和蛋白质水平分析hBD-2的表达情况并同步检测细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性.采用RT-PCR法从被转染的细胞中扩增出一条约240 bp的片段,其大小与预测相符.采用Western blot 法, 用抗His抗体检测到细胞可溶性蛋白在约10 Kd 处有强反应条带显示,其大小与该重组质粒结构中由pCMV启动子驱动的基因片段有可能表达成肽链的分子量(10.1)相符. 双层肉汤琼脂平板扩散法结果显示:分别与正常细胞可溶性蛋白和培养上清比较,转染重组质粒的COS-7细胞的可溶性蛋白及培养上清在金黄色葡萄球菌的平板上均形成明显抑菌环.这些结果提示:所建立的hBD-2哺乳类动物细胞表达系统能有效表达和分泌活性hBD-2.
本研究旨在探索建立能有效錶達和分泌人類β-防禦素-2 (hBD-2),其錶達產物又易于被檢測和分離純化的哺乳類動物細胞錶達繫統的可能性及技術路線.將hBD-2的全長cDNA片段插入編碼雙重報告基因Myc和6 箇多聚組氨痠(His)的真覈錶達質粒pcDNA3.1/Myc-His(+),構建齣C耑帶Myc和6×His的rpcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2.用脂質體轉染法將此重組真覈錶達載體導入COS-7細胞,分彆從mRNA和蛋白質水平分析hBD-2的錶達情況併同步檢測細胞可溶性蛋白及培養上清的抗菌活性.採用RT-PCR法從被轉染的細胞中擴增齣一條約240 bp的片段,其大小與預測相符.採用Western blot 法, 用抗His抗體檢測到細胞可溶性蛋白在約10 Kd 處有彊反應條帶顯示,其大小與該重組質粒結構中由pCMV啟動子驅動的基因片段有可能錶達成肽鏈的分子量(10.1)相符. 雙層肉湯瓊脂平闆擴散法結果顯示:分彆與正常細胞可溶性蛋白和培養上清比較,轉染重組質粒的COS-7細胞的可溶性蛋白及培養上清在金黃色葡萄毬菌的平闆上均形成明顯抑菌環.這些結果提示:所建立的hBD-2哺乳類動物細胞錶達繫統能有效錶達和分泌活性hBD-2.
본연구지재탐색건립능유효표체화분비인류β-방어소-2 (hBD-2),기표체산물우역우피검측화분리순화적포유류동물세포표체계통적가능성급기술로선.장hBD-2적전장cDNA편단삽입편마쌍중보고기인Myc화6 개다취조안산(His)적진핵표체질립pcDNA3.1/Myc-His(+),구건출C단대Myc화6×His적rpcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2.용지질체전염법장차중조진핵표체재체도입COS-7세포,분별종mRNA화단백질수평분석hBD-2적표체정황병동보검측세포가용성단백급배양상청적항균활성.채용RT-PCR법종피전염적세포중확증출일조약240 bp적편단,기대소여예측상부.채용Western blot 법, 용항His항체검측도세포가용성단백재약10 Kd 처유강반응조대현시,기대소여해중조질립결구중유pCMV계동자구동적기인편단유가능표체성태련적분자량(10.1)상부. 쌍층육탕경지평판확산법결과현시:분별여정상세포가용성단백화배양상청비교,전염중조질립적COS-7세포적가용성단백급배양상청재금황색포도구균적평판상균형성명현억균배.저사결과제시:소건립적hBD-2포유류동물세포표체계통능유효표체화분비활성hBD-2.
