CAJ | 학술논문

目的以逆转录病毒PLXSN为载体,构建重组逆转录病毒C-末端缺陷的JAK3[c-term deficient JAK3, JAK3(ΔC)]载体PLJAK3(ΔC),以BALB/c 3T3为靶细胞,转染JAK3(ΔC) cDNA,检测JAK3(ΔC)蛋白在真核细胞中的表达情况.为利用JAK3(ΔC)对白血病进行基因治疗的实验研究打基础.方法用限制性内切酶法从质粒PcDNA3-JAK3(ΔC)中分离目的基因片段,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PLJAK3(ΔC),通过转化感受态细菌扩增并检测DNA序列及限制性内切酶酶切鉴定;用脂质体LIPOFECTAMINE介导法将PLJAK3(ΔC)转染包装细胞PA317细胞,并用G418筛选抗性细胞克隆,收集病毒;用该病毒感染靶细胞BALB/c 3T3,G418筛选抗性克隆并测定病毒滴度;抗性细胞扩增培养,细胞溶解后经免疫沉淀(IP)、Western blotting 检测BALB/c 3T3细胞中JAK3(ΔC)的表达情况.结果①重组逆转录病毒载体PLJAK3(ΔC)酶切和DNA测序均表明含有2796 bp的JAK3(ΔC)基因;②病毒滴度为1.2×104 CFU/ml;③PLJAK3(ΔC)转染BALB/C 3T3细胞中表达出了JAK3(ΔC)蛋白,其相对分子质量为107×103.结论该研究构建的C-末端缺陷JAK3重组逆转录病毒载体PLJAK3(ΔC)能有效感染PA317包装细胞并产生高滴度病毒,同时该病毒能有效将目的基因片段导入真核细胞中并表达.
목적이역전록병독PLXSN위재체,구건중조역전록병독C-말단결함적JAK3[c-term deficient JAK3, JAK3(ΔC)]재체PLJAK3(ΔC),이BALB/c 3T3위파세포,전염JAK3(ΔC) cDNA,검측JAK3(ΔC)단백재진핵세포중적표체정황.위이용JAK3(ΔC)대백혈병진행기인치료적실험연구타기출.방법용한제성내절매법종질립PcDNA3-JAK3(ΔC)중분리목적기인편단,련접도역전록병독재체PLXSN다극륭위점상구건중조역전록병독재체PLJAK3(ΔC),통과전화감수태세균확증병검측DNA서렬급한제성내절매매절감정;용지질체LIPOFECTAMINE개도법장PLJAK3(ΔC)전염포장세포PA317세포,병용G418사선항성세포극륭,수집병독;용해병독감염파세포BALB/c 3T3,G418사선항성극륭병측정병독적도;항성세포확증배양,세포용해후경면역침정(IP)、Western blotting 검측BALB/c 3T3세포중JAK3(ΔC)적표체정황.결과①중조역전록병독재체PLJAK3(ΔC)매절화DNA측서균표명함유2796 bp적JAK3(ΔC)기인;②병독적도위1.2×104 CFU/ml;③PLJAK3(ΔC)전염BALB/C 3T3세포중표체출료JAK3(ΔC)단백,기상대분자질량위107×103.결론해연구구건적C-말단결함JAK3중조역전록병독재체PLJAK3(ΔC)능유효감염PA317포장세포병산생고적도병독,동시해병독능유효장목적기인편단도입진핵세포중병표체.