生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2002年
2期
167-171
,共5页
葛晓春%陈继超%王文漪%曹凯鸣%孙崇荣
葛曉春%陳繼超%王文漪%曹凱鳴%孫崇榮
갈효춘%진계초%왕문의%조개명%손숭영
NsLTP%定点突变%硫氧还蛋白融合表达载体%荧光标记脂质
NsLTP%定點突變%硫氧還蛋白融閤錶達載體%熒光標記脂質
NsLTP%정점돌변%류양환단백융합표체재체%형광표기지질
对水稻非特异性脂质转移蛋白(Nospecific lipidtransfer protein,nsLTP)LTP110中结构重要的5个氨基酸位点进行了定点突变,测序结果证实了突变体构建成功.在尝试了多种大肠杆菌表达系统进行表达之后,发现硫氧还蛋白融合表达载体适合于LTP110野生型及突变体的表达.将编码野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A,D45A,C50A蛋白的cDNA顺序克隆进两种硫氧还蛋白表达载体并对其表达情况进行了比较:pTrxFus载体可以在宿主菌GI724中以较低水平表达野生型LTP110及突变体Y17A,P72L,R46A融合蛋白,但不能表达D45A和C50A融合蛋白;pET32a(+)载体可以在宿主菌BL21(DE3)trxB-中以可溶蛋白的形式表达野生型及所有突变型融合蛋白,且表达量比在pTrxFus载体/GI74突主菌中表达量高.对pET32a(+)载体中表达的LTP110融合蛋白进行了纯化,并利用带有荧光标记的脂肪酸分子对其测活,结果表明表达的野生型LTP110分子具有结合脂质的活性.
對水稻非特異性脂質轉移蛋白(Nospecific lipidtransfer protein,nsLTP)LTP110中結構重要的5箇氨基痠位點進行瞭定點突變,測序結果證實瞭突變體構建成功.在嘗試瞭多種大腸桿菌錶達繫統進行錶達之後,髮現硫氧還蛋白融閤錶達載體適閤于LTP110野生型及突變體的錶達.將編碼野生型LTP110及突變體Y17A,P72L,R46A,D45A,C50A蛋白的cDNA順序剋隆進兩種硫氧還蛋白錶達載體併對其錶達情況進行瞭比較:pTrxFus載體可以在宿主菌GI724中以較低水平錶達野生型LTP110及突變體Y17A,P72L,R46A融閤蛋白,但不能錶達D45A和C50A融閤蛋白;pET32a(+)載體可以在宿主菌BL21(DE3)trxB-中以可溶蛋白的形式錶達野生型及所有突變型融閤蛋白,且錶達量比在pTrxFus載體/GI74突主菌中錶達量高.對pET32a(+)載體中錶達的LTP110融閤蛋白進行瞭純化,併利用帶有熒光標記的脂肪痠分子對其測活,結果錶明錶達的野生型LTP110分子具有結閤脂質的活性.
대수도비특이성지질전이단백(Nospecific lipidtransfer protein,nsLTP)LTP110중결구중요적5개안기산위점진행료정점돌변,측서결과증실료돌변체구건성공.재상시료다충대장간균표체계통진행표체지후,발현류양환단백융합표체재체괄합우LTP110야생형급돌변체적표체.장편마야생형LTP110급돌변체Y17A,P72L,R46A,D45A,C50A단백적cDNA순서극륭진량충류양환단백표체재체병대기표체정황진행료비교:pTrxFus재체가이재숙주균GI724중이교저수평표체야생형LTP110급돌변체Y17A,P72L,R46A융합단백,단불능표체D45A화C50A융합단백;pET32a(+)재체가이재숙주균BL21(DE3)trxB-중이가용단백적형식표체야생형급소유돌변형융합단백,차표체량비재pTrxFus재체/GI74돌주균중표체량고.대pET32a(+)재체중표체적LTP110융합단백진행료순화,병이용대유형광표기적지방산분자대기측활,결과표명표체적야생형LTP110분자구유결합지질적활성.
