CAJ | 학술논문

目的:观察体外成骨诱导培养液条件下骨髓基质干细胞与细胞支架β-磷酸三钙体外复合培养后的成骨活性,以验证兔骨髓基质干细胞在体外向成骨细胞转化的能力,并进行对照比较.方法:实验于2003-10/2004-02在解放军第二军医大学长征医院骨科实验室完成.取健康成年新西兰大白兔7只,将抽取的骨髓置于加入地塞米松、β-甘油磷酸钠及维生素C的DMEM标准培养液中培养.对获得的兔骨髓基质干细胞以倒置显微镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色等手段进行生长状态观察及生物学特性鉴定.然后将骨髓基质干细胞与β-磷酸三钙体外复合培养1周后自体回植兔肌肉内,分别在4周和8周后取材,观察其成骨能力以组织学方法检测,并与未复合的β-磷酸三钙的细胞做自身对照比较.结果:实验选取的7只兔全部进入结果分析.①细胞的生长状况及形态特征:细胞全骨髓法培养24～48 h,细胞开始贴壁,呈短梭形,贴壁细胞呈成纤维细胞集落方式生长.细胞培养5～7d,细胞集落生长逐渐密集,细胞体积逐渐增大,向长梭形转变,部分细胞呈多角形.②细胞生长曲线:传至第3代细胞,1～3 d细胞增殖缓慢,为潜伏期,3～5 d后细胞大量扩增,6 d后细胞达到顶点进入平台期.第1,2,4代细胞的生长曲线基本与第3代相似.③细胞贴壁率:各代细胞的贴壁率未见明显差异,一般2 h开始贴壁,2～8 h前贴壁率增加较快,8～14 h贴壁率达80%～90%.④细胞分裂指数:细胞早期分裂较慢,培养5～8 d分裂指数最高,可达10%～15%.表现为胞核增大,双核增多.1～4代核分裂率基本相似.⑤细胞超微结构观察.结果:培养至第2代,骨髓基质干细胞透射电镜下细胞内开始出现大量胶原.⑥血清碱性磷酸酶检测结果:骨髓基质干细胞染色后,血清碱性磷酸酶显示红棕色沉淀,细胞密集区颜色较深.第3代细胞血清碱性磷酸酶染色阳性率可达85%以上.⑦细胞免疫组化Ⅰ型胶原检测结果:各代细胞Ⅰ型胶原免疫组化染色均为阳性,胞浆呈红棕色.⑧肌内成骨活性观察:骨髓基质干细胞/β-磷酸三钙复合物植入体内4周,可见新生骨样基质.8周后新生骨量明显增多,可见典型的骨组织结构.而未复合细胞的人工骨孔隙内仅见大量纤维结缔组织,体内培养4周及10周时均未见骨组织形成.结论:体外培养条件下,骨髓基质干细胞在条件培养液中具有与成骨细胞相似的形态特征、生长特点和功能性表现,短期内可以获得大量具有成骨能力的细胞.复合β-磷酸三钙载体后,出现异位成骨现象,为临床骨组织工程技术的研究提供了理论依据和参数. 目的:觀察體外成骨誘導培養液條件下骨髓基質榦細胞與細胞支架β-燐痠三鈣體外複閤培養後的成骨活性,以驗證兔骨髓基質榦細胞在體外嚮成骨細胞轉化的能力,併進行對照比較.方法:實驗于2003-10/2004-02在解放軍第二軍醫大學長徵醫院骨科實驗室完成.取健康成年新西蘭大白兔7隻,將抽取的骨髓置于加入地塞米鬆、β-甘油燐痠鈉及維生素C的DMEM標準培養液中培養.對穫得的兔骨髓基質榦細胞以倒置顯微鏡、透射電鏡、堿性燐痠酶染色、Ⅰ型膠原免疫組化染色等手段進行生長狀態觀察及生物學特性鑒定.然後將骨髓基質榦細胞與β-燐痠三鈣體外複閤培養1週後自體迴植兔肌肉內,分彆在4週和8週後取材,觀察其成骨能力以組織學方法檢測,併與未複閤的β-燐痠三鈣的細胞做自身對照比較.結果:實驗選取的7隻兔全部進入結果分析.①細胞的生長狀況及形態特徵:細胞全骨髓法培養24～48 h,細胞開始貼壁,呈短梭形,貼壁細胞呈成纖維細胞集落方式生長.細胞培養5～7d,細胞集落生長逐漸密集,細胞體積逐漸增大,嚮長梭形轉變,部分細胞呈多角形.②細胞生長麯線:傳至第3代細胞,1～3 d細胞增殖緩慢,為潛伏期,3～5 d後細胞大量擴增,6 d後細胞達到頂點進入平檯期.第1,2,4代細胞的生長麯線基本與第3代相似.③細胞貼壁率:各代細胞的貼壁率未見明顯差異,一般2 h開始貼壁,2～8 h前貼壁率增加較快,8～14 h貼壁率達80%～90%.④細胞分裂指數:細胞早期分裂較慢,培養5～8 d分裂指數最高,可達10%～15%.錶現為胞覈增大,雙覈增多.1～4代覈分裂率基本相似.⑤細胞超微結構觀察.結果:培養至第2代,骨髓基質榦細胞透射電鏡下細胞內開始齣現大量膠原.⑥血清堿性燐痠酶檢測結果:骨髓基質榦細胞染色後,血清堿性燐痠酶顯示紅棕色沉澱,細胞密集區顏色較深.第3代細胞血清堿性燐痠酶染色暘性率可達85%以上.⑦細胞免疫組化Ⅰ型膠原檢測結果:各代細胞Ⅰ型膠原免疫組化染色均為暘性,胞漿呈紅棕色.⑧肌內成骨活性觀察:骨髓基質榦細胞/β-燐痠三鈣複閤物植入體內4週,可見新生骨樣基質.8週後新生骨量明顯增多,可見典型的骨組織結構.而未複閤細胞的人工骨孔隙內僅見大量纖維結締組織,體內培養4週及10週時均未見骨組織形成.結論:體外培養條件下,骨髓基質榦細胞在條件培養液中具有與成骨細胞相似的形態特徵、生長特點和功能性錶現,短期內可以穫得大量具有成骨能力的細胞.複閤β-燐痠三鈣載體後,齣現異位成骨現象,為臨床骨組織工程技術的研究提供瞭理論依據和參數.
목적:관찰체외성골유도배양액조건하골수기질간세포여세포지가β-린산삼개체외복합배양후적성골활성,이험증토골수기질간세포재체외향성골세포전화적능력,병진행대조비교.방법:실험우2003-10/2004-02재해방군제이군의대학장정의원골과실험실완성.취건강성년신서란대백토7지,장추취적골수치우가입지새미송、β-감유린산납급유생소C적DMEM표준배양액중배양.대획득적토골수기질간세포이도치현미경、투사전경、감성린산매염색、Ⅰ형효원면역조화염색등수단진행생장상태관찰급생물학특성감정.연후장골수기질간세포여β-린산삼개체외복합배양1주후자체회식토기육내,분별재4주화8주후취재,관찰기성골능력이조직학방법검측,병여미복합적β-린산삼개적세포주자신대조비교.결과:실험선취적7지토전부진입결과분석.①세포적생장상황급형태특정:세포전골수법배양24～48 h,세포개시첩벽,정단사형,첩벽세포정성섬유세포집락방식생장.세포배양5～7d,세포집락생장축점밀집,세포체적축점증대,향장사형전변,부분세포정다각형.②세포생장곡선:전지제3대세포,1～3 d세포증식완만,위잠복기,3～5 d후세포대량확증,6 d후세포체도정점진입평태기.제1,2,4대세포적생장곡선기본여제3대상사.③세포첩벽솔:각대세포적첩벽솔미견명현차이,일반2 h개시첩벽,2～8 h전첩벽솔증가교쾌,8～14 h첩벽솔체80%～90%.④세포분렬지수:세포조기분렬교만,배양5～8 d분렬지수최고,가체10%～15%.표현위포핵증대,쌍핵증다.1～4대핵분렬솔기본상사.⑤세포초미결구관찰.결과:배양지제2대,골수기질간세포투사전경하세포내개시출현대량효원.⑥혈청감성린산매검측결과:골수기질간세포염색후,혈청감성린산매현시홍종색침정,세포밀집구안색교심.제3대세포혈청감성린산매염색양성솔가체85%이상.⑦세포면역조화Ⅰ형효원검측결과:각대세포Ⅰ형효원면역조화염색균위양성,포장정홍종색.⑧기내성골활성관찰:골수기질간세포/β-린산삼개복합물식입체내4주,가견신생골양기질.8주후신생골량명현증다,가견전형적골조직결구.이미복합세포적인공골공극내부견대량섬유결체조직,체내배양4주급10주시균미견골조직형성.결론:체외배양조건하,골수기질간세포재조건배양액중구유여성골세포상사적형태특정、생장특점화공능성표현,단기내가이획득대량구유성골능력적세포.복합β-린산삼개재체후,출현이위성골현상,위림상골조직공정기술적연구제공료이론의거화삼수.