荧光定量PCR用于按蚊体内疟原虫子孢子检测的研究
형광정량PCR용우안문체내학원충자포자검측적연구
Detection of Plasmodium sporozoites in mosquitoes by using fluorescent quantitative PCR
  • 万方数据
    中国血吸虫病防治杂志 중국혈흡충병방치잡지
    CHINESE JOURNAL OF SCHISTOSOMIASIS CONTROL
    2012年 4期 445-449 ,共5页

    刘耀宝%周华云%汪圣强%李菊林%朱韩武%朱国鼎%顾亚萍%王伟明%曹俊%高琪

    류요보%주화운%왕골강%리국림%주한무%주국정%고아평%왕위명%조준%고기

    荧光定量PCR%按蚊%疟原虫子孢子%虫种鉴别 熒光定量PCR%按蚊%瘧原蟲子孢子%蟲種鑒彆
    형광정량PCR%안문%학원충자포자%충충감별
    目的 建立一种用于按蚊体内疟原虫子孢子定量检测和虫种鉴别的荧光定量PCR方法.方法 采用针对4种人体疟原虫18S rRNA基因属特异性保守区的1对引物,以疟原虫18S rRNA基因重组质粒与按蚊DNA的混合物为模板,进行反应体系和反应条件优化,验证方法的特异性,并通过熔解曲线分析进行虫种鉴别.应用阴性按蚊DNA稀释的间日疟原虫18S rRNA基因重组质粒为模板制作标准曲线,并分别以质粒DNA和实验室子孢子感染阳性的按蚊DNA为模板分析建立的荧光定量PCR方法的敏感性.在反应体系中加入不同部位、不同用量按蚊DNA,以探讨按蚊DNA对检测效果的影响.结果 该方法对按蚊、人血DNA均无扩增,对4种疟原虫DNA均有特异性扩增且扩增产物的熔解温度(Tm)易于区分,三日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫的Tm值分别为71.0、72.7、73.9℃和75.9℃.标准曲线中循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的相关性(相关系数r=-0.99).最低可以检出含50拷贝的质粒DNA或32倍稀释的子孢子阳性按蚊DNA样本.按蚊DNA对荧光定量PCR反应具有抑制作用.荧光定量PCR的Ct值在实验内和实验间均具有良好的重现性.结论 新建立的SYBR Green Ⅰ染料荧光定量PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于按蚊体内疟原虫子孢子的检测,并可同时对4种人体疟原虫进行鉴别.
    목적 건립일충용우안문체내학원충자포자정량검측화충충감별적형광정량PCR방법.방법 채용침대4충인체학원충18S rRNA기인속특이성보수구적1대인물,이학원충18S rRNA기인중조질립여안문DNA적혼합물위모판,진행반응체계화반응조건우화,험증방법적특이성,병통과용해곡선분석진행충충감별.응용음성안문DNA희석적간일학원충18S rRNA기인중조질립위모판제작표준곡선,병분별이질립DNA화실험실자포자감염양성적안문DNA위모판분석건립적형광정량PCR방법적민감성.재반응체계중가입불동부위、불동용량안문DNA,이탐토안문DNA대검측효과적영향.결과 해방법대안문、인혈DNA균무확증,대4충학원충DNA균유특이성확증차확증산물적용해온도(Tm)역우구분,삼일학원충、악성학원충、란형학원충화간일학원충적Tm치분별위71.0、72.7、73.9℃화75.9℃.표준곡선중순배역치(Ct치)여모판농도구유량호적상관성(상관계수r=-0.99).최저가이검출함50고패적질립DNA혹32배희석적자포자양성안문DNA양본.안문DNA대형광정량PCR반응구유억제작용.형광정량PCR적Ct치재실험내화실험간균구유량호적중현성.결론 신건립적SYBR Green Ⅰ염료형광정량PCR방법구유교고적민감성화특이성,가용우안문체내학원충자포자적검측,병가동시대4충인체학원충진행감별.
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