CAJ | 학술논문

目的体外构建重组人细胞色素P450 2C9(CYP2C9)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达体系,且利用该体系研究药物对CYP2C9基因多态性酶抑制程度的差异性.方法将CYF2C9*1(野生型)和通过定点突变PCR法获得的等位基因突变克隆CYP2C9*2(R144C突变体)和CYP2C9*3(1359L突变体)电穿孔转化酿酒酵母后,差速离心法制备酿酒酵母微粒体,蛋白免疫印迹法检测3种CYP2C9微粒体蛋白的表达;HPLC法检测CYP2C9*1与特异性底物双氯芬酸的反应,记录产物峰面积值,利用PrismDemo软件计算米氏常数(Km)值;利用荧光底物BOMCC对3个等位基因进行酶活性分析,分别计算Km、最大酶促反应速度(Vmax)和内在清除率.采用荧光高通量方法测定5种药物(甲苯磺丁脲、磺胺苯比唑、酮康唑、氟西汀和泰洛平)对酶的抑制程度.结果蛋白免疫印迹结果表明,3个等位基因均表达目的蛋白.CYP2C9*1代谢双氯芬酸的Km值为5.34±0.96μmol/L;以BOMCC为底物时,CYP2C9*1和CYP2C9*2的Km值分别为16.94±4.78、34.73±5.51 μmol/L,Vmax分别为0.21±0.10、0.12±0.01 pmobf(min·pmol P450),内在清除率分别为0.012±0.003、0.003±0.0001 μl/(min·pmolP450);CYP2C9*3无催化活性.5种药物对CYP2C9*1的抑制程度:磺胺苯比唑>酮康唑>氟西汀>甲苯磺丁脲>泰洛平;对CYP2C9*2的抑制程度:磺胺苯比唑>甲苯磺丁脲>酮康唑>氟西汀>泰洛平.结论成功构建了重组人细胞色素CYP2C9及其多态性等位基因(CYP2C9*2、CYP2C9*3)酿酒酵母表达系统;初步建立了药物对CYP2C9基因多态性酶的抑制作用体外检测体系,为指导临床联合用药奠定了基础.
목적 체외구건중조인세포색소P450 2C9(CYP2C9)양주효모(Saccharomyces cerevisiae)표체체계,차이용해체계연구약물대CYP2C9기인다태성매억제정도적차이성.방법 장CYF2C9*1(야생형)화통과정점돌변PCR법획득적등위기인돌변극륭CYP2C9*2(R144C돌변체)화CYP2C9*3(1359L돌변체)전천공전화양주효모후,차속리심법제비양주효모미립체,단백면역인적법검측3충CYP2C9미립체단백적표체;HPLC법검측CYP2C9*1여특이성저물쌍록분산적반응,기록산물봉면적치,이용PrismDemo연건계산미씨상수(Km)치;이용형광저물BOMCC대3개등위기인진행매활성분석,분별계산Km、최대매촉반응속도(Vmax)화내재청제솔.채용형광고통량방법측정5충약물(갑분광정뇨、광알분비서、동강서、불서정화태락평)대매적억제정도.결과 단백면역인적결과표명,3개등위기인균표체목적단백.CYP2C9*1대사쌍록분산적Km치위5.34±0.96μmol/L;이BOMCC위저물시,CYP2C9*1화CYP2C9*2적Km치분별위16.94±4.78、34.73±5.51 μmol/L,Vmax분별위0.21±0.10、0.12±0.01 pmobf(min·pmol P450),내재청제솔분별위0.012±0.003、0.003±0.0001 μl/(min·pmolP450);CYP2C9*3무최화활성.5충약물대CYP2C9*1적억제정도:광알분비서>동강서>불서정>갑분광정뇨>태락평;대CYP2C9*2적억제정도:광알분비서>갑분광정뇨>동강서>불서정>태락평.결론 성공구건료중조인세포색소CYP2C9급기다태성등위기인(CYP2C9*2、CYP2C9*3)양주효모표체계통;초보건립료약물대CYP2C9기인다태성매적억제작용체외검측체계,위지도림상연합용약전정료기출.